激光捕获显微切割液相色谱质谱 (LCM-LC/MS) 对肺结核患者药物的空间量化
Summary
在这里, 我们描述了一个协议使用激光捕获显微切割结合 LC/MS 分析, 以空间量化的药物分布在肺结核肉芽肿。该方法具有广泛的适用性, 以量化在高空间细节组织内的药物浓度。
Abstract
结核病仍然是全球发病率和死亡率的主要原因。迫切需要改进现有药物方案和开发新型疗法。在肺肉芽肿的低血管坏死区 (caseum) 中, 服用结核药物来达到和杀菌细菌的能力是治疗成功的关键。因此, 有效的治疗方案必须含有有利的 caseum 渗透特性的药物。目前用于量化生物组织中药物水平的 LC/MS 方法的空间分辨能力有限, 难以准确确定小组织内的绝对药物浓度, 如坏死性肉芽肿。在这里, 我们提出了一个协议结合激光捕获显微解剖 (LCM) 的病理不同的组织区域与 LC/MS 量化。这种技术提供绝对量化的药物在肉芽肿 caseum, 周围细胞病变和无关肺组织, 因此, 准确地确定是否有杀菌浓度正在实现。除了结核病的研究, 该技术还有许多潜在的应用, 在空间上解决的药物定量的疾病组织。
Introduction
空间分辨和量化药物水平的能力是确定抗结核药物是否在灭菌浓度的肺部病变中达到细菌亚群的关键要求1。特别重要的是确定药物渗入病变坏死的核心 (称为 caseum), 它通常含有最高的杆菌数量, 由于缺乏血管化, 药物可能无法进入。
传统的评估病灶穿透的方法, 包括肺切除病灶的均匀化, 其次是溶剂萃取和液相色谱质谱 (LC/MS) 分析, 是高度敏感和选择性的药物兴趣。然而, 这些方法提供的空间信息较差, 仅限于原始匀质组织的大小。基于质谱的成像方法, 如基质辅助激光解吸电离 (MALDI)2,3, 解吸电喷雾电离 (方案)4或液体增强表面萃取5, 6提供高度空间解析的成像能力, 但由于不同的细胞的异质离子抑制效应和分析方法的不同提取效率, 直接量化可能是极具挑战性或不可能的。或组织类型7。此外, 大多数直接组织 MS 成像方法本身的敏感性比 LC/MS, 由于缺乏色谱分离的内源物种竞争电离和较低的溶剂萃取效率的药物从组织。
激光捕获显微切割 (LCM) 结合 LC/MS 分析已被常规应用于分离和表征不同的组织区域的蛋白质组学研究8,9和最近用于药物量化的剂量动物组织10。在这里, 我们提出了一个优化的协议, 应用 lcm 结合 lc/ms (LCM-lc/ms) 分析, 以量化抗结核药物在不同的肉芽肿隔间。在激光捕获显微切割过程中, 紫外线激光通过显微镜目标聚焦到组织切片上, 通过遵循用户定义的路径切割和分离所需的组织区域。对于重力辅助 LCM (用于这项研究的技术), 组织部分安装在薄聚合物膜 (PET 或钢笔) 上, 组织被捕获在幻灯片下方的收集管帽中。这些药物从切除的组织中提取出来, 并使用标准的 LC/MS 方法进行量化。所需收集的组织数量最终取决于组织中药物的预期浓度和 LC/MS 方法的敏感性。对于大多数药物治疗水平的分析和分析使用常规三重四极质谱仪, 300万µm2 (3 毫米2) 的组织表面面积是足够的。
该协议描述了由 LCM-LC/MS 提供的空间轮廓和完全量化的强大组合, 在结核肉芽肿的所有隔间提供绝对药物浓度。该技术还可用于确定许多不同疾病组织的药物浓度, 提供重要的药物发现和发展信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
需要在空间上解决肺结核病变中的药物量化, 以确定药物暴露是否能达到对居住在不同病变隔间的细菌种群的杀菌浓度。这里所描述的 LCM-LC/MS 方法可以在所有病变舱室内绝对量化抗结核药物, 包括富含细菌的 caseum, 总共只使用 1-3 组织切片。传统的组织均匀化和 LC/MS 在组织中药物定量的方法往往缺乏空间特异性, 以解决特定的病变舱室, 甚至当它是可能的, 有很大的潜力交叉污染细胞和人工提取过?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Paul 奥布莱恩, Marizel 米娜和伊莎贝拉弗里德曼的动物实验, Jacquie 冈萨雷斯和丹妮尔从 NIH/NIAID 帮助与伽玛辐照兔组织之前, 激光捕获显微切割和 Jansy Sarathy 的手稿想法和建议。这项工作得到了比尔和梅琳达盖茨基金会 (OPP1174780) 和 NIH 共享仪器赠款1S10OD018072 的资助。我们感谢 Eliseo a Eugenin 提供了对莱卡 LMD 6500 显微镜的访问, 并分享了专门知识和建议。LMD 6500 的采购和持续支持由国家心理健康补助金研究所、MH096625、国家神经疾病和中风研究所、NS105584、PHRI 资助 (e.a. e) 和葛兰素 (e.a. e) 资助。
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
Riferimenti
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