Пространственная количественного определения наркотиков в поражении туберкулезом легких лазером захватить Microdissection жидкость хроматографии масс-спектрометрия (LCM-LC/МС)
Summary
Здесь мы описываем протокол, с помощью лазерного захвата microdissection наряду с анализом LC/MS поддается пространственно-дистрибутивов наркотиков в течение туберкулеза гранулемы. Этот подход имеет широкую применимость для количественного определения концентрации препарата в тканях при высоких пространственных деталей.
Abstract
Туберкулез по-прежнему является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Срочно требуются усовершенствования существующих получающим и развитие Роман терапии. Способность дозированная Противотуберкулезных препаратов и стерилизовать бактерий в плохо васкуляризированной некротические регионов (caseum) легких гранулемы имеет решающее значение для успешного терапевтического вмешательства. Поэтому эффективные терапевтические схемы должны содержать наркотиков с благоприятным caseum проникновения свойствами. Текущий LC/MS методы для количественного определения уровень препарата в биологических тканях имеют ограниченные возможности пространственного разрешения, что делает его трудно точно определить абсолютное наркотиков концентрации в секциях малых ткани например, в рамках Некротические гранулемы. Здесь мы представляем протокол, сочетая лазерного захвата microdissection (LCM) регионов патологически различных тканей с квантификацией LC/MS. Этот метод обеспечивает абсолютную количественного определения наркотиков в пределах caseum гранулемы, окружающих клеточных поражений и посторонним легочной ткани и, таким образом, точно определяет, достигаются ли бактерицидные концентрации. Помимо исследования туберкулеза техника имеет множество потенциальных приложений для количественного определения пространственно решена наркотиков в пораженной ткани.
Introduction
Способность пространственно решить и количественно оценить уровень препарата является важным требованием для определения, является ли противотуберкулезных препаратов достичь бактериальных субпопуляций в легких поражений в стерилизации концентрации1. Особое значение, является определение проникновение наркотиков в ядро некротические поражения (так называемый caseum), который обычно содержит наибольшее количество бацилл и могут быть плохо доступны наркотиков из-за отсутствия васкуляризации.
Традиционные методы оценки поражения проникновения, которые включают гомогенизации подакцизным легких повреждений следуют жидкостной экстракции и жидкостной хроматографии масс-спектрометрия (LC/МС) анализа, весьма чувствительны и селективного для препараты интерес. Однако эти методы предлагают бедных пространственной информации, ограничивается размер оригинального гомогенизированные ткани. Массы спектрометрии-подходы на основе изображений, например при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации (MALDI)2,3, десорбции электроспрей ионизации (Дези)4 или жидкость повышенной поверхностной добычи5, 6 предлагают весьма пространственно решена изображений возможностей, но прямой количественной оценки может быть чрезвычайно сложным или невозможным из-за гетерогенных ионных подавления эффекты и различные эффективность извлечения аналита из различных ячейки или ткани типа7. Кроме того наиболее прямым ткани MS изображений подходы являются по своей природе менее чувствительны, чем LC/МС из-за отсутствия хроматографического разделения видов эндогенные, конкурирующих за ионизации и снижению эффективности жидкостной экстракции препарата из ткани.
Лазерная захвата microdissection (LCM) в сочетании с LC/MS анализ обычно применяется для изоляции и характеризуют собственный ткани регионов для протеомических исследований8,9 и недавно использовали для количественного определения наркотиков в дозированной 10животных тканей. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, применяя LCM, в сочетании с анализом LC/мс (LCM-LC/МС) для количественного определения Противотуберкулезных препаратов в течение различных гранулемы отсеков. В процессе лазерной microdissection захвата УФ лазер направлена через микроскоп цель на разделе ткани, который режет и изолирует области желаемого ткани, следуя пути определяется пользователем. Для гравитации помощь LCM (техника, используемая для этого исследования), в разделе ткани монтируется на тонкой полимерной мембраны слайд (PET или пера) и ткани захватывается в коллекции трубка Крышка, расположенного ниже слайд. Препараты извлекаются из подакцизным ткани и количественно с помощью стандартных подходов LC/MS. Количество ткани, должны быть собраны в конечном итоге определяется от ожидаемой концентрации препарата в ткани и чувствительность метода LC/MS. Для большинства анализ наркотиков дозированной на терапевтических уровней и анализируются с помощью обычной тройной квадрупольным масс-спектрометром, 3 миллиона мкм2 (3 мм2) ткани площадь поверхности является достаточным.
Этот протокол описывает мощной комбинацией пространственного профилирования и полной количественной оценки предлагаемых LCM-LC/MS, обеспечивая абсолютную наркотиков концентрации в течение всех отсеков ТБ гранулемы. Техника может также применяться для определения концентрации наркотиков во многих различных больной тканях, предоставление жизненно наркотиков открытие и разработка информации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка пространственно решена наркотиков в легочного туберкулеза поражений требуется определить, достигает ли воздействия наркотиков для стерилизации концентрации бактериальных популяций, проживающих в различных поражения отсеков. LCM-LC/MS метод, описанный здесь позво…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Paul O’Brien, Marizel Мина и Изабелла Фридман для экспериментов на животных, Jacquie Гонсалес и Danielle Вайнер из низ/NIAID за помощь с гамма облучение тканей кролик до лазерных захвата microdissection и Jansy Sarathy для рукописи мысли и советы. Эта работа была поддержана финансирование от Билла и Мелинды Гейтс (OPP1174780) и низ совместно инструментария Грант 1S10OD018072. Мы благодарим Eliseo а. Eugenin за предоставление доступа к микроскоп Leica ЛМД 6500 и обмен опытом и советы. Покупки и постоянной поддержки, ЛМД 6500 финансируется Национальный институт психического здоровья Грант, MH096625, Национальный институт неврологических нарушений и инсульта, NS105584, PHRI финансирования (E.A.E) и ГСК вклад (E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
Riferimenti
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
