Immunophenotyping de Orthotopic la homoplastia (Syngeneic) de Adenocarcinoma Ductal pancreática KPC primaria murinas por citometría de flujo
Summary
El procedimiento experimental en el immunophenotyping de homoinjertos PDAC Murino ortotópico pretende perfilar el inmuno-microambiente tumoral. Los tumores son orthotopically implantado mediante cirugía. Tumores de 200 – 600 mm3 en tamaño fueron cosechados y disociados para preparar suspensiones de unicelular, seguidos del análisis de marcador múltiple inmunológico FACS utilizando diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia.
Abstract
Tumores (syngeneic) homoplastia son el caballo de batalla de investigación preclínica de la inmuno-Oncología (entrada-salida) de hoy. El microambiente del tumor (TME), particularmente sus inmune-componentes, es de vital importancia para el pronóstico y la predicción de los resultados del tratamiento, especialmente los de inmunoterapia. TME inmune-componentes están compuestos de diferentes subconjuntos de células inmunes tumor-infiltración evaluables por FACS de varios colores. Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) es entre el malignances mortales falta de opciones de buen trato, así una necesidad médica urgente y no satisfecha. Una razón importante para su no respuesta a diversos tratamientos (quimio-, apunta, I/O) ha sido su abundante TME, formado por fibroblastos y leucocitos que protegen las células del tumor de estas terapias. Orthotopically PDAC implantada parece más precisa recuperar la TME de los cánceres pancreáticos humanos que los modelos convencionales de (SC) subcutáneos.
Tumores de la homoplastia (KPC) son transplantes de ratón espontáneo PDAC origina KPC-ratones transgénicos (KrasG12D / +/ /Pdx1-53– / –PCre) (KPC-GEMM). El tejido del tumor primario se corta en fragmentos pequeños (~ 2 mm3) y trasplantado por vía subcutánea (SC) a los destinatarios syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 semanas de edad). Los homoinjertos fueron entonces quirúrgico orthotopically trasplantado en el páncreas de ratones C57BL/6 nueva junto con la implantación de SC, que volúmenes tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 días. Sólo tumores de 400 – 600 mm3 fueron cosechados por el procedimiento de autopsia aprobado y limpiarse para eliminar los tejidos no tumorales adyacentes. Se disocia según el protocolo utilizando un Disociador de tejido en suspensión unicelular, seguida de tinción con paneles designados de anticuerpos marcados con fluorescencia para diversos marcadores de células inmunes diferentes (linfoide, mieloide y NK, DCs). Las muestras teñidas se analizaron varios colores FACS para determinar el número de células inmunes de diferentes linajes, así como su porcentaje relativo dentro de los tumores. Los perfiles inmunes de los tumores ortotópicos entonces fueron comparados con los de tumores de SC. Los datos preliminares demostraron significativamente elevadas infiltración TILs/TAMs en tumores en el páncreas y mayor infiltración de células B en orthotopic en lugar de tumores SC.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) provoca casi la mitad un millón mortalidades por todo el mundo anualmente, uno de los asesinos de cáncer top 5. Hay pocas opciones de tratamiento eficaz y no inmunoterapias aprobadas; por lo tanto, se necesitan desesperadamente nuevos tratamientos. Tipos de cáncer están siendo reconocidos cada vez más como enfermedades inmunológicas, incluyendo la PDAC, además de las enfermedades genéticas como hoy. Factores inmunológicos y genéticos probablemente determinaría pronóstico de la enfermedad así como el tratamiento de los resultados. Los tumores evaden la vigilancia inmune del anfitrión y eventualmente avanzan para causar la muerte. Muchos de estos procesos inmunes producen en el microambiente tumoral (TME)1,2,3,4 donde diferentes tipos de células inmunes interactúan con las células del tumor, uno con el otro y con otro tumor componentes stromal, directamente o indirectamente vía citoquinas que determinan en última instancia, resultado de la enfermedad. Por lo tanto, caracterización de los componentes inmunes de tumor de la TME o tumor immunophenotyping, incluyendo subtyping, numeración y localización de distintos linajes de células inmunes, es fundamental para la comprensión de la inmunidad antitumoral. En el caso de PDAC, se ha propuesto que elevado macrófagos supresores tumorales infiltrantes (TAM) y células B han llevado a la prevención de la infiltración de células T y la activación y los niveles de fibrosis5,6.
El enfoque común para investigar experimentalmente TMEs inmunes sería usando sustituto modelos animales preclínicos de tumor, tumor de ratón principalmente relevantes modelos7, especialmente ratón syngeneic (homoinjerto) o modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) de cánceres, en la supuesta semejanza de ratón y humano para tumores e inmunidad8,9. Se entiende en realidad que hay diferencias inherentes entre los dos especies10,11.
Los tumores de ratón trasplantado tienen ventajas operacionales significativas en tumores espontáneos7, es decir, un desarrollo de tumores sincronizado, en contraste con el desarrollo de espontánea del tumor parental de GEMM. Homoinjertos de tumores murinos espontáneos se consideran tumores primarios nunca haber sido manipularon in vitroy ratón original espejado tumor histo- / molecular patología7, así como posibles perfiles inmunes. Estos homoinjertos murinos son considerados a menudo “una versión del ratón de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs)”. Por lo tanto tienen probablemente una mejor traducción de syngeneic de la célula convencional línea derivada ratón tumores12. En particular, muchos homoinjertos se derivan de GEMM específico donde se han diseñado mecanismos de enfermedades humanas específicas, por ejemplo mutaciones oncogénicas driver, y estos homoinjertos deben por lo tanto tienen ventajas a su relevancia clínica. En particular, la KPC GEMM desarrollar ratón PDAC dentro de 15 a 20 semanas de edad, que recapitula morfológicamente enfermedad humana predominantemente bien-moderadamente-distinguido arquitectura glandular y altamente enriquecido estroma. Este modelo también recoge las características genéticas más comunes de PDAC humano, es decir, Kras activa la mutación y pérdida-de-función P53, que ocurren en el 90% y 75% de PDAC humano, respectivamente de5,6.
Sitios del trasplante también se han sugerido para desempeñar un papel en la traducibilidad de la modelo. El específico entorno de tejido, como un entorno de orthotopic correspondiente, podría ser un nicho para tumores específicos para entornos de progreso, en contraposición a la subcutánea (SC) de uniforme para los tumores comúnmente trasplantados. Sería de particular interés if, o, qué diferencia existe entre los dos sitios de trasplante, en términos de microambiente inmunológico y la relevancia en cáncer en humanos, por ejemplo. en el caso de la PDAC.
Uno de los aspectos más importantes del perfil inmune o Inmunofenotipificación, es determinar infiltrantes de tumor de las células inmunes de diferentes linajes, los números, porcentaje relativo dentro de los tumores, así como sus Estados de activación y ubicaciones. Esto incluye lymphoctyes de infiltratrating de tumor (TILs, tanto T – y B-), macrófagos infiltrantes de tumor (TAMs), infiltrantes de tumor de células de asesino naturales (NKs) y reside en el tumor dendrítico de las células3,13,14 , 15 , 16 , 17y la localización subcelular de ciertas células18,19,20, etcetera. Fluorescencia activada célula clasificación (FACS) o flujo cytometry es una tecnología de detección unicelular que comúnmente se utiliza para medir los parámetros específicos de una célula. Varios colores las medidas de la citometría de flujo marcadores múltiples en una sola celda3,4,21 y es el método más comúnmente utilizado para determinar el número y porcentaje relativo de diferentes subconjuntos de células inmunes, las de los tumores incluidas.
Este informe describe los procedimientos para el perfilado de tumor infiltrante de células inmunes: 1) implantación de homoinjertos tumor orthotopic PDAC ratón, junto con la implantación de SC; 2) tumor tejido cosecha y preparación de la célula vía disociación del tumor; 3) análisis de citometría de flujo de todas las células derivadas de tumores, como una línea de base; 4) comparación de perfiles de línea de base de ambos enfoques de trasplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque estudios con tumores SC se realizan más fácilmente, orthotopically implantado modelos de tumores pueden ser potencialmente más relevantes para los estudios de Farmacología Preclínica (particularmente las investigaciones I/O) para proporcionar la traducción mejorada. Este informe tiene como objetivo ayudar a la lectores/audiencia interesada a ser capaces de visualizar directamente los procedimientos técnicos que se pueden utilizar en sus investigaciones respectivas. Nuestros protocolos demuestran que orthoto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores le agradezco Dr. Jody Barbeau – crítica de la lectura y edición del manuscrito y gracias a Ralph Manuel para el diseño de obras de arte. Los autores quisieran agradecer al equipo corona Bioscience Oncología inmuno-Oncología biomarcadores y equipo de Oncología En el Vivo , por su gran esfuerzo técnico.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
Riferimenti
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
