Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis
Summary
Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.
Abstract
Le circuit de rétino têtard Xenopus , composé des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans le œil qui font synapses directement sur les neurones dans le tectum optique, est un modèle populaire pour l’étude des circuits neuronaux comment s’auto-assembler. La capacité à réaliser ensemble patch clamp enregistrements de neurones tectal record réponses évoquée par le CJR, soit in vivo de cellules ou en utilisant une préparation de tout le cerveau, a généré un grand nombre de données à haute résolution sur les mécanismes sous-jacents normaux et la formation des circuits anormal et la fonction. Nous décrivons ici comment effectuer la préparation in vivo , la préparation originale de tout le cerveau, et plus récemment développé préparation de tranches de cerveau horizontale pour obtenir des enregistrements de germes entiers patch clamp de neurones opposantes. Chaque préparation a des avantages uniques expérimentales. La préparation in vivo permet l’enregistrement de la réponse directe des neurones opposantes à des stimuli visuels projetés sur le œil. La préparation de tout le cerveau permet les axones RGC être activé de façon très contrôlée, et la préparation de tranches de cerveau horizontal permet l’enregistrement de travers toutes les couches du tectum.
Introduction
Le circuit de rétino est le composant principal du système visuel amphibiens. Il est composé des CGR dans l’oeil, qui projettent leurs axones vers le tectum optique où ils forment des connexions synaptiques avec les neurones post-synaptiques opposantes. Le circuit de rétino têtard Xenopus est un modèle de développement populaire pour étudier la fonction et la formation des circuits neuronaux. Il y a beaucoup d’attributs du circuit rétino de ce têtard qui rendre un puissant modèle expérimental1,2,3. Un attribut important et la mise au point du présent article, est la capacité de mener des cellules entières patch clamp enregistrements de neurones opposantes, in vivo ou en utilisant une préparation de tout le cerveau. Avec une plate-forme d’électrophysiologie équipée d’un amplificateur qui prend en charge et de courant-potentiel imposé modes d’enregistrement, enregistrements de germes entiers patch clamp permettent électrophysiologie un neurone se caractériser à haute résolution. Ainsi, les cellules entières patch clamp enregistrements de neurones générés à travers les étapes clés de la formation des circuits rétino ont fourni une compréhension détaillée et complète du développement et la plasticité intrinsèque4,,5 , 6 , 7 et synaptique8,9,10,11 propriétés. Combinant des enregistrements de neurone tectal germes entiers patch clamp, la capacité d’exprimer des gènes ou des morpholinos d’intérêt dans ces neurones12et une méthode pour évaluer le comportement visuel de guidée par un évitement visuel établi essai13 favorise la identification des liens entre les molécules, fonction du circuit et le comportement.
Il est important de noter que le type de haute résolution données acquises à partir d’enregistrements de pince pour le patch à germes entiers ne sont pas possibles à l’aide de nouvelles approches d’imagerie tels que l’indicateur de calcium génétique GCaMP6, car bien qu’en utilisant des indicateurs de calcium permet l’imagerie de calcium dynamique à travers de grandes populations de neurones en même temps, il est non directe ou pince de manière évidente que les paramètres électriques spécifiques peuvent être obtenues en mesurant la fluorescence delta dans les corps cellulaires et n’a aucun moyen de tension le neurone pour mesurer relations courant-tension. Clairement, ces deux approches distinctes, d’enregistrements électrophysiologiques et imagerie calcique, possèdent des atouts sans chevauchement et générer différents types de données. Ainsi, la meilleure approche dépend de la question expérimentale spécifique abordée.
Ici, nous décrivons notre méthode d’acquisition des cellules entières patch clamp enregistrements des neurones du tectum optique tadpole à l’aide d’une préparation en vivo , préparation de tout le cerveau, et une version plus récente modification préparation de tout le cerveau qui a été mis au point dans notre laboratoire14 . Dans la section résultats de représentant, nous démontrer les avantages expérimentales de chaque préparation et les différents types de données qui peuvent être obtenues. Les limites et les points forts de les différentes préparations, ainsi que des conseils pour le dépannage, sont inclus dans la section « Discussion ».
Protocol
Representative Results
Discussion
Toutes les méthodes décrites dans cet ouvrage sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber15). Par étape 42, les têtards sont suffisamment vaste et suffisamment développée pour que les insectes broches peuvent être placés sur chaque côté du cerveau in vivo enregistrements et pour mener à bien la dissection du cerveau entier. Aux premiers stades, lorsque les têtards so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financée par la NIH subvention SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
Riferimenti
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