Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis
Summary
En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.
Abstract
El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus , compuesto de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el ojo que forman sinapsis directamente sobre las neuronas en El tectum óptico, es un modelo popular para estudiar circuitos neuronales cómo uno mismo-montar. La capacidad para llevar a cabo toda célula grabaciones de abrazadera de parche de neuronas tectal y al registro grave-evocado las respuestas, ya sea en vivo o mediante una preparación de todo el cerebro, ha generado un gran cuerpo de datos de alta resolución sobre los mecanismos subyacentes normales y anormal, circuito de formación y función. Aquí describimos cómo realizar la preparación en vivo , la preparación original de todo el cerebro, y más recientemente desarrollaron preparación de corte horizontal del cerebro para obtener grabaciones de abrazadera de parche de células enteras de neuronas tectal. Cada preparación tiene ventajas experimentales únicas. La preparación en vivo permite la grabación de la respuesta directa de neuronas tectal de aumento a los estímulos visuales que se proyectan en el ojo. La preparación de todo el cerebro permite que los axones RGC a activarse de forma muy controlada, y la preparación de corte horizontal del cerebro permite la grabación de a través de todas las capas del tectum.
Introduction
El circuito retinotectal es el componente principal del sistema visual de anfibios. Se compone de las RGCs en el ojo, que proyectan sus axones al tectum óptico donde forman conexiones sinápticas con las neuronas postsinápticas de tectal. El circuito de retinotectal renacuajo Xenopus es un popular modelo de desarrollo para el estudio de la función y formación de circuitos neuronales. Hay muchos atributos de circuito de retinotectal de este renacuajo que potente modelo experimental1,2,3. Un atributo importante y el foco de este artículo, es la capacidad para llevar a cabo grabaciones de abrazadera parche de células enteras de neuronas tectal, en vivo o utilizando una preparación de todo el cerebro. Con un aparejo de electrofisiología equipado con un amplificador que soporte el voltaje y corriente abrazadera modos de grabación, grabaciones de células enteras patch clamp permiten electrofisiología de la neurona que se caracterizará en alta resolución. Como resultado, toda célula parche abrazadera las grabaciones de las neuronas tectal en las distintas etapas claves de la formación de circuito retinotectal han proporcionado una comprensión detallada y completa del desarrollo y plasticidad intrínseca4,5 , 6 , 7 y sináptica8,9,10,11 propiedades. Combinación de grabaciones de celulares todo parche abrazadera neurona tectal, la habilidad de expresar genes o morfolinos de interés en estas neuronas12y un método para evaluar comportamiento guiado visual a través de un test de evitación visual establecido13 promueve el identificación de enlaces entre moléculas, la función del circuito y el comportamiento.
Es importante tener en cuenta que el tipo de alta resolución, datos obtenidos de las grabaciones de celular todo parche abrazadera no están posibles utilizar nuevos enfoques proyección de imagen tales como el indicador de calcio genética GCaMP6, porque aunque utilizando indicadores de calcio permite la proyección de imagen de calcio dinámica a través de grandes poblaciones de neuronas simultáneamente, no directa o de manera obvia de que los parámetros eléctricos específicos pueden obtenerse midiendo la fluorescencia del delta en la somata y no hay forma de tensión de la abrazadera la neurona para medir relaciones de corriente-tensión. Claramente estos dos enfoques distintos, las grabaciones electrofisiológicas y proyección de imagen del calcio, poseen fortalezas sin traslapo y generar diferentes tipos de datos. Así, el mejor método depende de la pregunta experimental concreta que se aborda.
Aquí, describimos nuestro método para adquirir células enteras patch clamp las grabaciones de las neuronas del tectum óptico renacuajo con una preparación en vivo , preparación de todo el cerebro, y un más nuevo modificado preparación de todo el cerebro que se desarrolló en nuestro laboratorio de14 . En la sección de resultados de representante, nos demuestran las ventajas experimentales de cada preparación y los diferentes tipos de datos que pueden obtenerse. Los límites y fortalezas de las diferentes preparaciones, así como consejos para la solución de problemas, se incluyen en la sección de discusión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todos los métodos descritos en este trabajo están optimizados para la grabación de neuronas tectal de renacuajos entre la etapa de desarrollo 42 y 49 (puesta en escena según Neiuwkoop y Faber15). Por etapa 42, los renacuajos son suficientemente grande y suficientemente desarrollada para que los insectos pasadores pueden colocarse a ambos lados del cerebro para grabaciones en vivo y para llevar a cabo la disección de todo el cerebro. En etapas más tempranas, cuando los renacuajos son…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo de la beca del NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
Riferimenti
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