Tre-dimensionelle Organotypic kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer
Summary
Tre-dimensionelle organotypic kulturer af murine utricle og cochlea i optisk klare kollagen jeg geler Bevar medfødte væv morfologi, tillader mekanisk stimulering gennem tilpasning af matrix stivhed, og tillade virus-medieret gen levering.
Abstract
Sanseorganer i det indre øre er udfordrende for at studere i pattedyr på grund af deres manglende adgang til eksperimentelle manipulation og optisk observation. Desuden, selvom eksisterende kultur teknikker tillader biokemiske forstyrrelser, disse metoder ikke giver et middel til at studere virkningerne af mekanisk kraft og væv stivhed i udviklingen af de indre øre sanseorganer. Her beskriver vi en metode for tre-dimensionelle organotypic kultur intakt murine utricle og cochlea, der overvinder disse begrænsninger. Teknik til justering af en tre-dimensionel matrix stivhed beskrevet her tillader manipulation af elastisk kraft imod vækst af væv. Denne metode kan derfor bruges til at studere rollen af mekaniske styrker under indre øre udvikling. Derudover tillader kulturer virus-medieret gen levering, som kan bruges til eksperimenter med gevinst og tab-af-funktion. Denne kultur metode bevarer medfødte hårceller og støtte celler og fungerer som en potentielt bedre alternativ til den traditionelle to-dimensionelle kultur af vestibulære og auditive sanseorganer.
Introduction
Studiet af de fleste aspekter af pattedyr orgel udvikling er blevet fremmet af in vitro- systemer. To vigtigste metoder bruges nu til kulturen af vestibulære sanseorganer: frit svævende1 og vedhængende2 præparater. Begge metoder tillade undersøgelsen af hår celle sårbarheder3 og regenerering1,4 in vitro. Notch5,6, Wnt7,8og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades i det indre øre udviklingsmæssige roller har derudover blevet etableret, dels ved hjælp af in vitro- kulturer af sensoriske epitheler. Dog er cellevækst og differentiering kontrolleret, ikke kun gennem signalering af morphogens, men også gennem fysiske og mekaniske stikord såsom intercellulære kontakter, stivhed af ekstracellulære matrix, og mekanisk strække eller konstriktion. Rollen som sådan mekaniske stimuli er udfordrende at undersøge i den tredje indre øre in vivo. Derudover er eksisterende frit svævende og vedhængende kultur metoder ikke egnet til sådanne undersøgelser in vitro. Her vi beskrive en metode for tre-dimensionelle organotypic kultur i kollagen jeg geler af varierende stivhed. Denne metode i høj grad bevarer de vestibulære og cochlear sanseorganer i vivo arkitektur og giver mulighed for undersøgelse af virkningerne af mekaniske kraft på vækst og differentiering11.
Fordi mekaniske stimuli er kendt for at aktivere downstream molekylære begivenheder, såsom Hippo signalering vej12,13,14,15, er det vigtigt at være i stand til at kombinere mekaniske stimulation med biokemiske og genetiske manipulationer. Kultur metoden her tillader virus-medieret gen levering og kan derfor bruges til at studere både mekanisk og molekylær signalering under indre øre udvikling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De molekylære signaler, der mægle vækst og differentiering i det indre øre under udvikling er blevet studeret grundigt5,6,7,8,9,10. Dog tyder fremstillet af utricular modelsystem på, at mekanisk stikord, fornemmede gennem celle vejkryds og aktivering af Hippo signalering, også spille en vigtig rolle i disse processer<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi og A. Petelski for deres bidrag til den oprindelige forskning som denne protokol er baseret. Vi takker også J. lamaer og W. Makmura for teknisk bistand og husdyrhold. Vi anerkender NIDCD uddannelse grant T32 DC009975, NIDCD give R01DC015530, Robertson terapeutiske Udviklingsfond og Caruso Family Foundation for finansiering. Endelig, vi anerkender støtte fra Howard Hughes Medical Institute, som Dr. Hudspeth er en Investigator.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
