Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen
Summary
Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.
Abstract
De zintuigen van het binnenoor zijn uitdagend om te studeren bij zoogdieren als gevolg van hun onbereikbaarheid experimentele manipulatie en optische observatie. Bovendien, hoewel bestaande cultuur technieken toestaan biochemische verstoringen, deze methoden bieden niet een middel tot het bestuderen van de effecten van mechanische kracht en weefsel stijfheid tijdens de ontwikkeling van de zintuigen van het binnenoor. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur van de intact lymfkliertest utricle en slakkenhuis overwint deze beperkingen. De techniek voor aanpassing van de stijfheid van een drie-dimensionale matrix hier beschreven staat manipulatie van de elastische kracht tegen weefsel groei. Deze methode kan daarom worden gebruikt om te studeren van de rol van mechanische krachten tijdens de ontwikkeling van het binnenoor. Bovendien, toestaan de culturen virus-gemedieerde gene levering, die kan worden gebruikt voor experimenten van de winst – en verlies-van-functie. Deze methode van cultuur behoudt aangeboren haarcellen en ondersteunende cellen en fungeert als een potentieel superieur alternatief voor de traditionele tweedimensionale cultuur van vestibulaire en auditieve zintuigen.
Introduction
De studie van de meeste aspecten van zoogdieren orgel ontwikkeling is bevorderd door in vitro -systemen. Twee belangrijkste methoden worden nu gebruikt voor de cultuur van vestibulaire zintuigen: vrij zwevende1 en aanhangend2 preparaten. Beide methoden toestaan dat het onderzoek van Haarcel kwetsbaarheden3 en regeneratie1,4 in vitro. Bovendien hebben de ontwikkelingstoxiciteit rollen van de inkeping5,6, Wnt7,8en epidermale groeifactor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades in het binnenoor vastgesteld, gedeeltelijk door het gebruik van in vitro culturen van sensorische epitheel. Echter celgroei en differentiatie worden beheerd, niet alleen door middel van de signalering door morphogens, maar ook door middel van fysieke en mechanische signalen zoals intercellulaire contacten, de stijfheid van de extracellulaire matrix, en mechanische uitrekken of vernauwing. De rol van dergelijke mechanische stimuli is uitdagend om te onderzoeken in de ontwikkelingslanden binnenoor in vivo. Bovendien, bestaande vrij zwevende en aanhangend cultuur methoden zijn niet geschikt voor dergelijk onderzoek in vitro. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur in collageen gels ik verschillende stijfheid. Deze methode grotendeels bewaart de in vivo -architectuur van de vestibulaire en cochleair zintuigen en laat onderzoek naar de gevolgen van mechanische kracht voor de groei en differentiatie11.
Omdat de mechanische prikkels zijn bekend om te activeren downstream moleculaire gebeurtenissen, zoals de Hippo signalering traject12,13,14,15, is het belangrijk om het combineren van mechanische stimulatie te kunnen met biochemische en genetische manipulaties. De hier beschreven methode van cultuur virus-gemedieerde gene levering toestaat en kan daarom gebruikt worden om te studeren zowel mechanische als moleculaire signalering tijdens binnenoor ontwikkeling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De moleculaire signalen die bemiddelen groei en differentiatie in het binnenoor tijdens de ontwikkeling geweest bestudeerde uitvoerig5,6,7,8,9,10. Echter aanwijzingen het utricular modelsysteem verkregen dat mechanische signalen, voelde door cel kruispunten en de activering van Hippo signalering, ook een belangrijke rol in de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi, en A. Petelski voor hun bijdragen aan het oorspronkelijke onderzoek waarop dit protocol is gebaseerd. Wij danken ook J. Llamas en W. Makmura voor technische bijstand en de veehouderij. Wij erkennen NIDCD Training subsidie T32 DC009975, NIDCD verlenen R01DC015530, Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds en de Caruso Family Foundation voor financiering. Tot slot, wij erkennen steun van Howard Hughes Medical Institute, waarvan Dr. Hudspeth een onderzoeker is.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
