Summary

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

Published: June 01, 2018
doi:

Summary

Organotypic תלת מימדי התרבויות של מאתר utricle, שבלול ב שטיחות נקה קולגן אני ג ‘ לים שימור רקמות מולדת מורפולוגיה לאפשר גירוי מכני באמצעות התאמה של מטריקס נוקשות, אישור המסירה הגן וירוס בתיווך.

Abstract

אברי החישה של האוזן הפנימית הם מאתגרים ללמוד אצל יונקים בשל הנגישות שלהם כדי מניפולציה ניסויית והתבוננות אופטי. יתר על כן, למרות שיטות חקלאות הקיים לאפשר לפליטת הביוכימי, שיטות אלה אינם מספקים אמצעי כדי לבחון את השפעות כוח מכני וקשיחות ברקמות במהלך הפיתוח של אברי החישה באוזן הפנימית. כאן נתאר שיטת organotypic תלת מימדי התרבות של utricle מאתר ללא פגע, שבלול מתגבר על מגבלות אלה. הטכניקה עבור התאמת מנדנד מטריקס תלת מימדי המתוארים כאן מאפשר מניפולציה של כוח אלסטי מנוגדות של רקמה. שיטה זו ולכן ניתן ללמוד את התפקיד של כוחות מכני במהלך הפיתוח באוזן הפנימית. בנוסף, התרבויות אישור המסירה הגן וירוס בתיווך, אשר יכול לשמש לניסויים רווח, הפסד-של-פונקציה. שיטה זו תרבות משמרת תאים שיער מולדת של תמיכה תאים, משמש חלופה מעולה שעשוי להיות לתרבות דו-ממדית מסורתית של איברי חישה שיווי המשקל ושמיעתיים.

Introduction

כבר בהנחייתם של המחקר של רוב ההיבטים של התפתחות האיברים בתרבית של מערכות במבחנה . שתי השיטות העיקריות המשמשים כיום עבור התרבות של איברי חישה שיווי המשקל: לתרשים1 וההכנות חסיד2 . שתי השיטות היתר החקירה של תא שיער פגיעויות3 והתחדשות1,4 בתוך חוץ גופית. בנוסף, יש התפקידים התפתחותית של דרגה5,6,7,ונ ט8, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR)9,10 איתות cascades באוזן הפנימית הוקם, בין השאר, באמצעות תרבויות במבחנה של epithelia חושית. עם זאת, צמיחת תאים ובידול נשלטים, לא רק באמצעות איתות על ידי אורגניזם, אלא גם דרך רמזים הפיזי ועל מכניים כגון אנשי קשר המערכת, את הנוקשות של מטריצה חוץ-תאית, ו מכני מתיחה או כיווץ. התפקיד של גירויים מכניים כזה הוא מאתגר לחקור ב האוזן הפנימית המתפתח בתוך vivo. יתר על כן, קיימות שיטות התרבות לתרשים חסיד אינם מתאימים כגון לימודי חוץ גופית בתוך. כאן נתאר שיטת לתרבות organotypic תלת מימד של קולגן אני ג ‘ לים של נוקשות בדרגות שונות. בשיטה זו במידה רבה שומרת על הארכיטקטורה ויוו של אברי החישה שיווי המשקל, שבלול, מאפשר חקירה של השפעות כוח מכני בהתפתחותם11.

מאחר גירויים מכניים ידועים כדי להפעיל אירועים מולקולריים במורד הזרם, כגון ההיפופוטם איתות לשביל12,13,14,15, חשוב להיות מסוגל לשלב בין גירוי מכני עם מניפולציות גנטיות הביוכימי. שיטת תרבות המתוארים כאן אישורי המסירה הגן וירוס בתיווך, ולכן ניתן ללמוד מכני וגם מולקולרית איתות במהלך פיתוח באוזן הפנימית11.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של אוניברסיטת רוקפלר, של אוניברסיטת דרום קליפורניה. 1. (אופציונלי) הכנת קולגן אני הפתרון של הגידים Mouse-tail הערה: קולגן אני פתרונות זמינים מסחרית. בצע הוראות היצרן להכנה ג’ל. המתת חסד 5-10 …

Representative Results

אברי החישה שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים עובריים, תרבותי ב- 40-Pa קולגן אני ג’לים מחקה קשיות נמוכה תנאים עובריים11, שומרים על מבנים תלת מימדיים רגיל יחסית (איור 1) ולשמור על תאים שיער ו תומכים תאים (איור 2 , איור 3). …

Discussion

האותות מולקולרית כי הצמיחה התחלקות ובידול באוזן הפנימית במהלך הפיתוח כבר למד בהרחבה5,6,7,8,9,10. עם זאת, ראיות שהושגו ממערכת דגם utricular מרמז כי רמזים מכני, חש דרך צמתי תא והפעלה של היפו אי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ג’קובו א ד ר ד ר ג’יי Salvi, א Petelski על תרומתם למחקר המקורי שעליו מבוססת פרוטוקול זה. אנו מודים גם ג’יי לאמות, וו Makmura על גידול בעלי חיים וסיוע טכני. אנו להכיר מענק הכשרה NIDCD T32 DC009975, NIDCD הענק R01DC015530 רוברטסון טיפולית הקרן, הקרן המשפחתית קארוזו למימון. לבסוף, אנו להכיר תמיכה של הווארד יוז במכון הרפואי, אשר ד ר Hudspeth הוא חוקר.

Materials

#10 Surgical Blades Miltex 4-110
#5 Forceps Dumont 11252-20
100 mm Petri dish Sigma P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips USA Scientific 1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish Matsunami Glass USA Corporation D35-14-1.5-U
4 well plate Thermo Fisher Scientific 176740
4-Hydroxytamoxifen  Sigma H7904
60 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific 123TS1
Acetic acid  Sigma 537020
Ad-GFP Vector Biolabs 1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction Invitrogen A10262 
Anti-Myo7A Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) Santa Cruz sc-17320
Bicinchoninic acid assay Thermo Fisher Scientific 23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10340
Collagenase I Gibco 17100017
D-glucose Sigma G8270
DMEM/F12  Gibco 11320033
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16140063
Fibroblast growth factor Sigma F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Glutamine Sigma G8540
HBSS Gibco 14025092
Hemocytometer  Daigger EF16034F
HEPES Sigma H4034
Insulin Sigma I3536
Iridectomy scissors  Zepf Medical Instruments 08-1201-10  
Microinjector Narishige IM-6
Nicotinamide Sigma N0636
PBS (10X), pH 7.4 Gibco 70011044
PBS (1X), pH 7.4 Gibco 10010023
Phenol Red pH indicator  Sigma P4633 
Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs  2716
RFP antibody ChromoTek  5F8
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium hydroxide Sigma S8045
Sodium selenite Sigma S5261
Tabletop vortex  VWR 97043-562
Transferrin Sigma T8158
Trypan blue  Sigma T6146

References

  1. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
  2. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  3. Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
  4. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
  5. Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
  6. Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
  7. Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
  8. Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
  9. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  10. White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
  11. Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
  12. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  13. Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
  14. Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
  15. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  16. . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  17. Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
  18. Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
  19. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
  20. Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
  21. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  22. Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
  23. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
  24. Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
  25. Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
  26. Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).

Play Video

Cite This Article
Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).

View Video