En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion
Summary
Der mangler en væsentlig lever donor, og kriterier for leveren er blevet udvidet. Normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) er blevet udviklet for at evaluere og redigere organfunktion. Denne undersøgelse viser en rotte model af NEVLP og tester pegyleret-katalase, evne til at afbøde lever bevarelse skade.
Abstract
Der findes en betydelig mangel på leveren allografts til transplantation, og svar er blevet udvidet, donor kriterierne. Som et resultat, der er indført normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) som en metode til at evaluere og redigere organfunktion. NEVLP har mange fordele i forhold til hypotermiske og subnormothermic perfusion herunder reduceret bevarelse skade, genoprettelse af normale organfunktion fysiologiske betingelser, vurdering af orgel ydeevne, og som en platform for orgel reparation , ombygning og modifikation. Både murine og svin NEVLP modeller er blevet beskrevet. Vi demonstrere en rotte model af NEVLP og bruge denne model til at vise en af sine vigtige applikationer – brug af en terapeutisk molekyle føjet til leveren perfusate. Katalase er en endogen reaktive ilt arter (ROS) skyllevæske og har vist sig for at mindske iskæmi-reperfusion i øjet, hjernen og lungekræft. Pegylation har vist sig at målrette katalase til endotelet. Her, vi tilføjet pegyleret-katalase (PIND-kat) til den base perfusate og demonstreret sin evne til at afbøde lever bevarelse skade. En fordel ved vores gnaver NEVLP model er, at det er billigt i forhold til større dyremodeller. En begrænsning af denne undersøgelse er, at det ikke i øjeblikket omfatter efter perfusion levertransplantation. Derfor, forudsigelse af funktionen efter organtransplantation kan ikke stilles med sikkerhed. Men rat levertransplantation model er veletableret og sikkert kunne bruges sammen med denne model. Afslutningsvis har vi påvist en billig, enkel, let replikerbar NEVLP model ved hjælp af rotter. Anvendelser af denne model kan omfatte testning roman perfusates og perfusate tilsætningsstoffer, test software designet for orgel evaluering og forsøg på at reparere organer.
Introduction
Der er 14,578 patienter på ventelisten til levertransplantation og cirka 7.000 transplantationer udføres pr. år1,2. Som svar på denne betydelige donor knaphed, har kriterierne for leveren donorer udvidet; disse er ofte omtales som marginale organer eller udvidede kriterier donorer og forventes at udføre mindre godt efter transplantation end standard kriterier allografts, med højere satser for primære graft dysfunktion og forsinket graft funktion3, 4,5,6. Som et resultat, der er indført NEVLP som en metode til at evaluere og redigere orgel funktion6,7. Vi har designet en rotte model af NEVLP og anvendt denne model til at vise en af sine vigtige potentielle applikationer – afprøvning af roman molekyle tilsætningsstoffer til leveren perfusate.
NEVLP er blevet evalueret i både murine (rotte) og Porcin modeller samt i kasserede menneskelige organer6,8,9. Resultaterne af de første humane forsøg af NEVLP har også for nylig blevet offentliggjort10. Selvom hypotermiske maskine perfusion er klart blevet standard for nyre bevarelse, er temperaturen på hvilke lever apparat perfusion skulle opstå stadig kontroversielt. NEVLP har mange foreslåede fordele i forhold til hypotermiske og subnormothermic perfusion. Disse omfatter reduceret bevarelse skade, genoprettelse af normale organfunktion under fysiologisk forhold, evnen til at vurdere orgel ydeevne, og som en platform for orgel reparation, ombygning og ændring7,11, 12,13,14,15,16,17.
Et betydeligt antal undersøgelser er blevet gennemført ved hjælp af svin NEVLP modeller. Selv om disse modeller er forholdsvis billige, når overvejer modeller ved hjælp af kasseret menneskelige organer eller humane kliniske forsøg, er de meget dyre i forhold til vores lille dyremodel for NEVLP. En betydelig del af den pr. eksperiment koster perfusate. Vi er i stand til at fuldføre en 4 h perfusion med 300 mL af perfusate til en relativt lav pris. Derudover er udgifterne til små dyr herunder rotter meget lav i forhold til prisen på svin.
I forhold til andre modeller af NEVLP i rotter, model præsenteres her er forholdsvis enkelt at implementere og har en bred vifte af applikationer. Perfusion kredsløb kan ses i figur 1. Perfusate starter i perfusate reservoir (1), som er en dobbeltvægget vandbeholder. Perfusate er trukket fra reservoiret af en rulle pumpe (2) og skubbet ind i en windkessel (3) og derefter oxygenator (4). Oxygenator er sat til modstrøms gas og perfusate flow til at give maksimal gasudveksling. Perfusate derefter provenuet til en opvarmning spole (5) indersiden perfusion herhen for at sikre, at det er ved fysiologisk temperatur, og en boble fælden (6) at forhindre perfusion af luftbobler der er før orgel (7) og post orgel (8) prøve havne, som tillader perfusate at være stikprøven. I perfusate indtaster derefter leveren via portalen vene kanyle. Portalen vene kanyle er knyttet til et pres skærm, der kortlægger værdier på data collection software. Perfusate derefter afslutter lever gennem IVC kanyle og flyder ud i pres equalizer blok (9). Endelig, perfusate er trukket fra pres blok tilbage gennem rulle pumpe og tømmes i reservoiret. Denne model omfatter kontinuerlig perfusion til Vena og udelader pulsatile strømmen til hepatisk arterie og dialyse bruges i nogle andre modeller, som hver kræver en særskilt og supplerende kredsløb, men har tidligere vist sig ikke at være kræves9,13.
For at udforske tilføjelsen af en ny terapeutisk molekyle til perfusate, valgte vi enzymet katalase. Katalase er en endogen ROS skyllevæske, der er en del af celler intern forsvar mekanisme til at afbøde virkningerne af ROS18. Katalase udtryk er øget hepatisk iskæmi reperfusion skade19. Eksperimentelle tilsætning af katalase har vist sig for at mindske iskæmi-reperfusion i øjet, hjernen og lungekræft20,21,22,23,24. Pegylation har vist sig at målrette katalase endothelium og støtte i katalase optagelse i endothelial celler25. PIND-kat er blevet administreret systemisk med begrænset virkning på reduktion af hepatisk iskæmi-reperfusion skade; men vi hypotese at tilføje PIND-kat til et isoleret organ perfusion kredsløb vil føre til forbedrede resultater26,27,28. Her, vi tilføje PIND-kat til vores base perfusate og demonstrere sin evne afbøde lever bevarelse skade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der findes en betydelig mangel på leveren allografts til transplantation og svar donor kriterier har været udvidet1,2,3,4,5. Som følge af mangel på donor er NEVLP blevet indført som en metode til at evaluere og redigere orgel funktion6,7. Vi har designet en rotte model af NEVLP. Desuden, vi har br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch fond for organtransplantation, Perfusion, teknik og Regeneration ved The Ohio State University.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
