Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.
Abstract
Die Reparatur der Doppelstrang-Brüche (DSB) in DNA ist ein hochgradig koordinierten Prozess, erfordern die Bildung und Auflösung der Reparatur Multi-Protein-komplexe. Dieser Prozess wird durch eine Vielzahl von Proteinen, die der Verein zu fördern und Abgrenzung von Proteinen an dieser Läsionen geregelt. Vielen Dank im großen Teil auf die Fähigkeit, funktionale Bildschirme eine riesige Bibliothek von Proteinen führen, gibt es eine größere Wertschätzung der Gene für die Doppel-Strang DNA Bruch Reparatur notwendig. Oft Knockout oder chemischen Inhibitors Bildschirme identifizieren Proteine beteiligt Reparaturprozesse mithilfe erhöhte Toxizität als Marker für ein Protein, das für DSB-Reparatur erforderlich ist. Zwar nützlich für identifizierende neuartige zelluläre Proteine, die bei der Aufrechterhaltung der Genom-Treue, erfordert Funktionsanalyse die Bestimmung der ob das Protein des Interesses Lokalisierung, Bildung oder Auflösung von Reparatur-komplexe fördert.
Die Anhäufung von Reparatur-Proteine kann ohne weiteres als unterschiedliche nuklearen Brennpunkte durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie erkannt werden. So können Assoziation und Dissoziation dieser Proteine an Standorten von DNA-Schäden durch die Beobachtung dieser nuklearen Brennpunkte in repräsentativen Abständen nach der Induktion der Doppel-DNA-Strangbrüche zugegriffen werden. Dieser Ansatz kann auch falsch lokalisierten Reparatur-Faktor-Proteine, identifizieren, wenn Reparatur Mängel nicht gleichzeitig mit unvollständigen Verzögerungen bei der Reparatur auftreten. In diesem Szenario können langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen entwickelt werden zum Ausdruck bringen, eine seltene schneiden Endonuklease (z.B. SceI) in den Zellen wo die Anerkennung-Website für das besagte Enzym in das zelluläre Genom integriert wurde. Die daraus resultierende Läsion ist besonders schwer zu lösen, wie treu Reparatur wird das Enzym Anerkennung Website, woraufhin eine weitere Runde der Spaltung wieder einzuführen. Infolgedessen sind Unterschiede in der Kinetik der Reparatur beseitigt. Wenn Reparatur komplexe nicht gebildet werden, hat Lokalisierung behindert worden. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik, die notwendigen Änderungen in Reparatur Kinetik sowie Reparatur Protein Lokalisierung zu identifizieren.
Introduction
Jeden Tag, jede Zelle im menschlichen Körper wird bombardiert mit einer geschätzten 10.000 DNA-Läsionen1. Diese existentielle Bedrohung gefährdet uns für Mutationen, Onkogenese sowie Zelle Tod. Zum Schutz der Genom-Treue haben Säugerzellen entwickelt, um auf DNA-Schäden mit einer komplexen Abfolge von Protein-Verbände und Änderungen reagieren. Diese Antwort gliedert sich in mehrere Wege, zusammen bekannt als DNA-Schaden Antwort (DDR)2,3. Die DDR besteht aus der Ansammlung von DNA-Reparatur-Proteine an DNA-Läsionen, koordiniert sowohl zeitlich als auch räumlich. DDR induziert häufig Zellzyklus Festnahme zur Vermeidung der Ausbreitung oder Verstärkung von Schäden, die während der Replikation von beschädigten DNA2,4,5auftreten können. Im Gegenzug ist es auch notwendig für die zelluläre Lebensfähigkeit ausschalten Zellzyklus Festnahme durch Reparatur komplexe absetze, nachdem die Reparatur abgeschlossen ist.
Unter den verschiedenen Arten von DNA-Schäden sind DSB die meisten schädlichen. DSB reparieren können Chromosomen-Rearrangements oder großflächige Streichungen wie der Verlust des gesamten Chromosoms Arme Nichtbeachtung. Die Reparatur des DSB gliedert sich in zwei Bahnen6,7,8. Homologe Rekombination (HR) erfordert eine Schwester Chromosom als DNA-Vorlage zu verwenden und somit beschränkt sich auf späte S und G2/M-Phase des Zellzyklus9,10. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) verfügt nicht über diese Einschränkungen aber kann verursachen kleine Deletionen bei der DSB11,12Reparatur.
DSB reparieren speziell und die DDR im Allgemeinen sind aktive Bereiche der Untersuchung. Trotz in bequem getrennten Bahnen organisiert wird, gibt es viel Redundanz. In der Tat sind viele Proteine (BRCA1, BRCA2 und komplexe z. B. RPA) in mehreren Bahnen13,14,15,16beteiligt. Die Reparatur einer Läsion durch einen Weg, kann zu einen Schaden Mittelstufe, die durch einen anderen Weg14repariert werden muss. Die Verflechtung dieser Wege, kombiniert mit ihrer komplexen Aufgabe recruiting die richtigen Proteine an die richtige Stelle für die genaue Zeitspanne notwendig, erfordert einen mehrstufigen Regulierungsprozess.
Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigt die Feinheiten der DDR durch den Nachweis, dass Reparatur Komplexbildung, Auflösung und Lokalisierung jeweils separat beeinträchtigt17sein können. Das übergeordnete Ziel der das folgende Protokoll soll endgültig sezieren die Fähigkeit der Zellen, DSB zu reparieren. Mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, kann Ansammlung von Reparatur-Proteine an den Standorten des Schadens zu den repräsentativen Zeitpunkten nach der Induktion der DSB visualisiert werden.
Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile für häufig verwendete Ansätze. Häufig ist die Reparatur zu einzelnen Zeitpunkten untersucht und nicht in der Lage, den dynamischen Prozess der Versammlung und Dissoziation der Reparatur komplexe vertreten. Beobachten das gesamte Spektrum der Reparatur von der erstmaligen Aktivierung der vollen Auflösung sorgt dafür, dass eine Verzögerung bei der Reparatur ist nicht als vollständige Hemmung misidentified. Umgekehrt, es versichert, dass die Induktion einer Reparatur-Antwort, die nicht in der Lage, diese Antwort zu inaktivieren ist nicht als die normale oder die übermäßige Aktivierung identifiziert ist.
Verzögerten Eiweiß Komplexbildung und die MIS Lokalisierung von Reparatur-Proteine können jedoch nicht eindeutig mit diesem Ansatz unterschieden werden. Um festzustellen, ob Reparatur-Proteine falsch lokalisierten versus in ihrer Lokalisation verzögert sind, kann eine “Long-Lasting” DSB durch enzymatische Spaltung der zellulären DNA eingeführt werden. Die daraus resultierende Läsion ist jedes Mal nachschneiden, die es repariert wird, wodurch sich unterschiedliche großen nuklearen Reparatur und Aufhebung der zeitlichen Beschränkung von der Einstellung. Dies kann erreicht werden, indem Sie ändern das bestehende Konzept mit dem Einsatz von einer seltenen schneiden Endonuklease (z.B. SceI) induzieren eine lang anhaltende DSB. Die Langlebigkeit der DSB ermöglicht die Visualisierung der schwer fassbaren Reparatur-Proteine durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Die verbesserte Fülle könnte auch die Visualisierung verbessern, bei der Erkennung durch Einschränkung der Antikörper-Qualität, ein Feature behindert wird, die nützlich sein könnten, wenn weniger untersuchten Proteine identifiziert werden, als mit Auswirkungen auf die DNA-Reparatur.
Insbesondere bieten wir explizite Anweisungen für ein Kostenloses Bild Verarbeitung und Analyse-Software (z. B.ImageJ). Dies entfernt eine große finanzielle Hürde in Bildanalyse, die Vernehmung von DNA-Reparatur von einem breiteren Publikum zu öffnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse von DNA-Schäden reparieren im allgemeinen und die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen ist speziell ein aktives Gebiet der Forschung, da deren Folgen Tumorgenese Grundlagenbiologie6,20 umfassen. Dieses Manuskript-Details, die ein Konzept, das genau den Beitrag von RAD51 und γ-H2AX Proteinen an die Auflösung des DSB durch HR. Ich freue mich, diese Methode seziert verwendet werden, um zusätzliche Funktionen des Reparatur-Proteine bei DSB<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Joel Sanneman und Dr. Philine Wangemann der konfokalen Mikroskopie Kern, finanziert von der Kansas State University College of Veterinary Medicine, für ihre Unterstützung der Bemühungen, diese Technik zu entwickeln. pCBASceI war ein Geschenk von Maria Jasin (Addgene Plasmid # 26477) 30. U2OS DR-GFP Zellen waren eine Art Geschenk von Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Riferimenti
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