DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize
Summary
Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.
Abstract
Çift iplikçikli tatili (DSBs) DNA tamiri oluşumu ve kararlılık-in çok protein onarım kompleksleri gerektiren son derece koordineli bir süreçtir. Bu işlem sayısız Dernek teşvik protein ve protein bu lezyonlar için ayırma tarafından düzenlenmiştir. Büyük ölçüde geniş bir kütüphane proteinlerin fonksiyonel ekranları gerçekleştirme olanağı sayesinde, iki iplikçikli DNA sonu tamiri için gerekli genler daha büyük bir takdir. İnhibitörü kez nakavt veya kimyasal ekranlarında proteinlerin tamir süreçlerinde yer alan kalem DSB onarım için gerekli olan bir protein için artan toksisite kullanarak tanımlayın. Tanımlayıcı roman hücresel proteinler genom sadakat korunmasında yer için yararlı olmasına rağmen fonksiyonel analiz olup faiz protein yerelleştirme, oluşumu veya onarım kompleksleri çözünürlüğü teşvik belirlenmesi gerekir.
Onarım proteinleri birikimi kolayca farklı nükleer foci ayirt mikroskobu tarafından tespit edilebilir. Böylece, dernek ve bu proteinler DNA hasarı sitelerdeki ayırma bu nükleer foci temsilcisi aralıklarla çift iplikli kırılmalara DNA indüksiyon sonra gözlemci tarafından erişilebilir. Onarım hataları tamir eksik gecikmeler ile aynı anda gerçekleşmez ise bu yaklaşım de yanlış yerelleştirilmiş onarım faktör proteinler, tanımlayabilir. Bu senaryoda, uzun süreli iki iplikçikli DNA kırılmalar nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) ifade ederek nerede tanıma site dedi enzim için hücresel genom entegre edilmiştir hücrelerdeki mühendislik. Elde edilen bu lezyon özellikle sadık onarım enzim tanıma sitesi, dekolte bir tur isteyen reintroduce çözmek zordur. Sonuç olarak, onarım kinetik farklılıkları ortadan kalkar. Onarım kompleksleri oluşur değil ise, yerelleştirme engelledi. Bu iletişim kuralı onarım kinetik hem de onarım protein yerelleştirme değişiklikleri tanımlamak gerekli yöntemleri açıklar.
Introduction
Her gün, insan vücudundaki her hücre bir tahmini 10.000 ile alı DNA lezyonlar1. Bu tehdit bize mutasyonlar, oncogenesis gibi hücre riski koyar ölüm. Genom sadakat korumak için memeli hücreleri DNA hasarı protein dernekler ve değişiklikler karmaşık bir dizi ile yanıtlamak için evrim geçirmiş. Bu yanıtı birden çok yolları, topluca bilinen DNA hasarı yanıt (DDR)2,3düzenlenmiştir. DDR DNA onarım proteinler, DNA lezyonlar, geçici ve dağınık şekilde koordine birikimi oluşur. DDR sık yayma veya hasarlı DNA2,4,5çoğaltma işlemi sırasında oluşabilecek hasar yoğunlaştırılması önlemek için hücre döngüsü tutuklama neden olmaktadır. Buna karşılık, aynı zamanda hücre döngüsü tutuklama onarım tamamlandıktan sonra onarım kompleksleri kesilmesi açmak hücresel canlılık için gereklidir.
Çeşitli DNA hasarı arasında DSBs en zararlı türleridir. DSBs onarmak için hata kromozom düzenlemeler veya kaybı gibi büyük ölçekli silme tüm kromozom silah neden olabilir. DSBs tamiri iki yolları6,7,8ayrılmıştır. Homolog rekombinasyon (HR) gerektirir bir kardeş kromozom DNA şablon olarak kullanmak ve böylece geç S ve G2/M hücre döngüsü9,10için aşama sınırlıdır. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan bu kısıtlamalar yoktur ancak küçük silme DSBs11,12tamirinde neden olabilir.
DSB onarım özellikle ve DDR genel olarak soruşturma etkin alanı vardır. Elverişli bir konuma sahip ayrılmış yollar organize rağmen büyük bir fazlalık var. Gerçekten de, birçok protein (BRCA1, BRCA2 ve örneğin karmaşık RPA) birden çok yolları13,14,15,16‘ söz konusu. Tarafından bir yolu, bir lezyonu tamiri için başka bir yolu14tarafından onarılması bir hasar ara yol açabilir. Zaman gerekli, kesin miktar için doğru yere doğru protein alımı onların karmaşık bir görev ile birlikte bu yollar intertwining çok katmanlı bir yasal işlem gerektirir.
Bir rapora DDR inceliklerini onarım karmaşık oluşumu, çözünürlük ve yerelleştirme her ayrı olarak Engelli17olabilir göstererek vurgulamaktadır. Aşağıdaki protokol genel yetenek hücre DSB onarmak için kesin olarak incelemek için hedeftir. Ayirt mikroskobu kullanılarak, sitelerde hasar onarım proteinlerin birikimi DSBs indüksiyon takip temsilcisi zaman noktalarda görüntülenmeyecektir.
Bu teknik yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar için birçok avantajı vardır. Sık sık, onarım incelenen tek zaman noktalarda ve derleme dinamik bir süreç ve onarım kompleksleri ayrışma temsil eden aciz. İlk harekete geçirmek gelen onarım dolu kararlılık için tam kapsamlı gözlem onarım gecikmeden tam inhibisyon tanımlanmış değil sağlar. Diğer taraftan, dedi yanıt devre dışı bırakma için bir onarım yanıt indüksiyon normal ya da aşırı harekete geçirmek tanımlanmış değil garanti eder.
Gecikmeli protein kompleksi oluşumu ve onarım proteinlerin mis yerelleştirme ancak, belirsizliğe yer bırakmadan bu yaklaşım ile ayırt edilebilir değil. Onların yerelleştirme gecikmeli onarım proteinler karşı yanlış lokalize olup olmadığını belirlemek için hücresel DNA enzimatik bölünme bir “uzun ömürlü” DSB tanıttı olabilir. Elde edilen bu lezyon, farklı büyük nükleer onarım odakta kaynaklanan ve zamansal kısıtlama işe kaldırma onarılana her zaman yüreği. Bu uzun ömürlü DSB ikna etmek için bir nadir kesme endonükleaz (Örneğin, SCEI) kullanımı ile mevcut yaklaşım değiştirerek elde edilebilir. DSBs uzun ömürlü ayirt mikroskobu tarafından zor tamir proteinlerin görselleştirme sağlar. Gelişmiş bereket da algılama sınırlama antikor kalitesinde az çalışılmış proteinler DNA tamiri üzerinde bir etkiye sahip olarak tanımlanan zaman yararlı olabilir bir özelliği tarafından engel görselleştirme artırmak.
Özellikle, bir ücretsiz görüntü işleme ve analiz yazılımı (Örneğin, ImageJ) için açık yönergeler sağlar. Bu DNA hasar tamiri daha geniş bir kitleye sorgulama açılış görüntü analizinde büyük bir finansal engelini ortadan kaldırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA analizi zarar onarım genel ve temel biyoloji6,20tumorigenesis sonuçları span çünkü çift iplikçikli DNA sonları tamiri özellikle etkin araştırma alanıdır. Bu el yazması Ayrıntılar doğru RAD51 ve γ-H2AX proteinleri DSBs saatlik seyir ileri, bu yöntemi yoluyla çözümlenmesi için katkısını dissects bir yaklaşım DSBs14onarım proteinlerin ek işlevler aydınlatmak için kullanılabilir. Onarım kinetik karşıla?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Joel Sanneman ve Dr Philine Wangemann tarafından Kansas State Üniversitesi Veteriner Tıp Fakültesi, çabaları bu tekniği geliştirmek için destek için finanse Confocal mikroskobu çekirdek, teşekkür ederim. pCBASceI Maria Jasin (Addgene plazmid # 26477) bir hediye oldu 30. U2OS DR-GFP hücreleri Maria Jasin18tür bir hediyeydi.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
