מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול זמן התגובה. ממפה את התפוצה המרחבית של אנזימטי לפעילות אנזימים המייצרים nicotinatmide אדנין dinucleotide פוספט (NAD(P)H) + H + ישירות בדגימות רקמה.
Abstract
מיפוי פעילות אנזימטי במרחב ובזמן חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של התנהגות התא בתוך הרקמות ומחלות. בחיי עיר פעילות חילוף החומרים מבחני יכול לספק מידע על חלוקת מרחבי פעילות חילוף החומרים בתוך רקמה. אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות האנזים לקטט דהידרוגנאז ישירות בדגימות רקמה. לקטט דהידרוגנאז הוא דטרמיננטה חשוב של אם נצרך גלוקוז יומרו האנרגיה דרך גליקוליזה אירובי או אנאירובי. פתרון המכיל NAD ו לקטט מסופק על קטע רקמה קפוא. תאים עם פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז יהיה להמיר את לקטט שסופקו פירובט, בעוד בו-זמנית המרת nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD) NADH ו פרוטון, אשר ניתן לאתרם מבוסס על הפחתת nitrotetrazolium כחול formazan, אשר הוא מדמיין כמו התמיסה כחול. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר. יישום פרוטוקול זה, מצאנו כי פעילות לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע השבתה הדרגתית זקיק השיער בתוך העור. החלת הפרוטוקול בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית חשף מכתים גבוה יותר ב בתרבית תאי גזע עובריים מאשר fibroblasts עובריים בעכבר. ניתוח של אבי העורקים העכבר טרי מבודד גילה מכתים בתאי השריר החלק בניצב אבי העורקים. המתודולוגיה המסופקים ניתן למפות במרחב הפעילות של אנזימים המייצרים פרוטון ברקמת קפואים או טריים.
Introduction
הבנה של המיקומים בתוך הרקמות שבו אנזימים יש פעילות גבוהה או נמוכה חיוני עבור פיתוח הבנה ופיזיולוגיה. רמות חלבון או תעתיק משמשים כתחליף לפעילות אנזימטיות. בעוד מחקרים כאלה יכולים להיות אינפורמטיבי, הם אינם מספקים מידע יכול להיות קריטי לקביעת הפעילות של אנזים, כגון שינויים post-translational, הנוכחות של חלבון מתחמי או הלוקליזציה של האנזים subcellular. כאשר פעילות אנזימטי נמדד באופן ישיר, הוא לעתים קרובות מנוטר ב lysates חלבון הומוגני יותר המכילים מידע אודות תאים בודדים בתוך התערובת או את התפוצה המרחבית של התאים עם פעילות גבוה או נמוך בתוך רקמה.
אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור מיפוי את התפוצה המרחבית של פעילות אנזימטי בתוך דגימת רקמה. המתודולוגיה מבוססת על מחקרים מוקדמים יותר הוכחת כי מלחי tetrazolium ניתן למקם את הפעילות של dehydrogenases, reductases ו oxidases רקמות קפוא1. באמצעות שיטות אלה, formazan לא מסיס-מים נוצר כאשר פרוטונים מועברים מלח2,tetrazolium3. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז מחוללת nadph של פרוטון, זוהתה עם פעילות tetrazolium. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז נמצא במעקב ב התלבט האירופית hepatocytes4, מכתשי מסוג 2 תאים של הריאות5 ו nephrons של כליות5. מלחי Tetrazolium שימשו גם לעקוב אחר פעילות transketolase רקמות קפואים6. בגישה דומה שימש לאחרונה כדי לפקח על הפעילות של dehydrogenases מרובות בתוך הרקמה זהה על שקופיות סמוכים7.
נתאר כאן שיטה לשימוש tetrazolium מלחי כדי לנטר את התפוצה המרחבית של פעילות לקטט דהידרוגנאז (איור 1). לקטט דהידרוגנאז ניתן להמיר פירובט שנוצרו על-ידי גליקוליזה בלי חולצה, ואת התגובה הפוכה. לקטט דהידרוגנאז פעילות היא אפוא דטרמיננטה חשוב של פירובט הכניסה לתוך מחזור חומצה tricarboxylic לעומת שלה הפרשת כפי לקטט. רמת חומצת החלב בדם משמשים לעתים קרובות כדי לאבחן מגוון של מחלות, כולל סרטן8,9,10, כי זה יכול לאותת כי מחלה או פציעה יש התאים הפגועים, האנזים שוחררה.
ישנם ארבעה גנים לקטט דהידרוגנאז: LDHA, LDHB, LDHC ו- LDHD11. LDHA ו- LDHB הם חשבו שהתעוררו כתוצאה לכפל ג’ין מוקדם LDHA12. LDH פעיל כמו tetramer, LDHA, LDHB יכול ליצור homotetramers ו- heterotetramers אחד עם השני. LDHA הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור פירובט, בעוד LDHB הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור לקטט, מעדיפים להמיר לקטט פירובט13. האמרגן LDHA מכיל אתרי קישור HIF1α, cMYC ו FOXM1 שעתוק גורמים11. בנוסף, כמו רבים אחרים אנזימים glycolytic14,15, LDH יכול להיות שונה על-ידי שינויים post-translational. קולטן גורם הצמיחה פיברובלסט 1 יכול phosphorylate LDHA Y10, המקדם גיבוש tetramer, או Y83, אשר מקדם NADH המצע איגוד16. LDHA יכול להיות גם acetylated17. מסיבות אלו, הבנה מלאה של פעילות LDH דורש ניטור רמות החלבון LDH אלא גם הפעילות של האנזים.
בנוסף השיטה שאנו מציגים כאן, גישות אחרות שימשו כדי לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז. ניתן לנטר פעילות לקטט דהידרוגנאז spectrophotometrically הומוגני חלבון lysate. הדור של NADH כפי מומר לקטט פירובט ניתן למדוד בהתבסס על ספיגת-340 nm, בעוד ניתן לנטר את היעלמותו של NADH כפי פירובט מומר לקטט18. לקטט דהידרוגנאז פעילות גם נמצא במעקב עם תהודה מגנטית (MRI). 13 C-פירובט יכול להינתן ו ניתן לנטר את ההמרה של פירובט תניקי כיחס בין [1 –13C] לקטט / [1 –13C] פירובט. גבוה יחסי של [1 –13C] לקטט / [1 –13C] פירובט נצפו סרטן רקמות19. בעוד גישות MRI יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז רגילה ורקמות המחלה, למתודולוגיות אין רזולוציה צריך לקבוע את רמת פעילות תאים מסוימים. המתודולוגיה שסופק כאן יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז באזורים רקמות, אפילו בתאים בודדים.
שימוש בבאתרו פעילות מבחני, מצאנו כי הפעילות של לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע זקיק השיער העכבר העור20. השתמשנו גם השיטה כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז ב בתרבית תאי גזע עובריים ומצא שהפעילות הוא גבוה בתאי גזע יותר בשכבה מזין. לבסוף אנחנו במעקב את הפעילות של לקטט דהידרוגנאז העכבר טרי לאבי העורקים, נצפתה צביעת תאי שריר חלק. נתאר כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר קפוא.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז או אחרים אנזימים מטבוליים הפקת NADH או nadph ל, סוגי תאים שונים בתוך רקמה או חלקים שונים של רקמה לאורך זמן. לקטט דהידרוגנאז הוא אנזים חשוב להבנת הביולוגיה של תאי גזע, גידולים, היכולת לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז בתאים בודדים…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים כדי HAC מן הלאומית המכון של R01 מדעי רפואי כללי GM081686, R01 AR070245, המכון הלאומי של כללי רפואי (מדעי R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע רוז והרי האל גאבא פרסים), הבריאות מרכז/UCLA CTSI NIH גרנט UL1TR000124, לוקמיה לימפומה החברה, השפעת איריס חזן הנשים פרסים של Jonsson מקיף במרכז לחקר הסרטן אל טוב ואל -חאק. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר של אלי את & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
