Métabolisme de cartographie : Surveiller l’activité de la Lactate déshydrogénase directement dans le tissu
Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique d’une enzyme qui génèrent nicotinatmide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H) + H + directement dans les échantillons de tissus.
Abstract
Cartographie de l’activité enzymatique dans le temps et l’espace est essentiel pour comprendre les bases moléculaires du comportement de cellules dans les tissus normaux et la maladie. Essais in situ de l’activité métabolique peuvent fournir des informations sur la distribution spatiale de l’activité métabolique dans un mouchoir en papier. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour surveiller l’activité de l’enzyme lactate déshydrogénase directement dans les échantillons de tissus. Déshydrogénase de lactate est un déterminant important de la question de savoir si glucose consommé sera converti en énergie par la glycolyse aérobie ou anaérobie. Une solution contenant du lactate et NAD est fournie pour une section de tissus congelés. Cellules avec haute lactate déshydrogénases convertira le lactate fourni en pyruvate, tandis que simultanément conversion fourni nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) à NADH et un proton, qui peut être détecté, basée sur la réduction des nitrotetrazolium bleu en formazan, qui est visualisé comme un précipité bleu. Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris. Application de ce protocole, nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est riche en cellules souches quiescentes follicule pileux dans la peau. Elle applique le protocole aux cellules souches embryonnaires de souris cultivées ont révélé une coloration plus élevée dans les cellules souches embryonnaires cultivées que les fibroblastes embryonnaires de souris. Analyse d’aorte fraîchement isolés de souris a révélé une coloration dans les cellules musculaires lisses perpendiculaire à l’aorte. La méthodologie fournie peut être utilisée pour mapper spatialement l’activité des enzymes qui génèrent un proton dans le tissu congelé ou fraîche.
Introduction
Comprendre les emplacements au sein des tissus dans lesquels enzymes ont une activité élevée ou faible est indispensable pour la physiologie et le développement de la compréhension. Niveaux de transcription ou de la protéine sont souvent utilisés comme substituts à l’activité enzymatique. Alors que ces études peuvent être informatifs, ils ne fournissent pas d’informations qui peuvent être essentielles pour la détermination de l’activité de l’enzyme, comme les modifications post-traductionnelles, la présence de complexes protéiques, ou la localisation subcellulaire de l’enzyme. Lorsque l’activité enzymatique est mesurée directement, il est souvent contrôlé dans les lysats de protéines homogénéisé qui n’est plus contiennent des informations sur des cellules individuelles dans le mélange ou la distribution spatiale des cellules ayant une activité au sein d’un tissu haute ou basse.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique dans un échantillon de tissu. La méthodologie est basée sur des études antérieures montrant que les sels de tétrazolium peuvent être utilisés pour localiser l’activité des déshydrogénases, réductases et oxydases en tissus congelés1. Avec ces méthodes, un formazan insolubles dans l’eau se forme lorsque les protons sont transférés à un tétrazolium sel2,3. Glucose-6-phosphate déshydrogénase génère NADPH et un proton et a été détecté avec activité de tétrazolium. Glucose-6-phosphate déshydrogénase a été contrôlé dans les hépatocytes flet européen4, dans les poumons de5 des cellules alvéolaires de type 2 et les néphrons du rein5. Sels de tétrazolium ont également été utilisés pour surveiller l’activité de la transcétolase en tissus congelés6. Une approche similaire a été récemment utilisée pour surveiller l’activité des déshydrogénases multiples dans le même tissu sur diapositives adjacentes7.
Nous décrivons ici une méthode pour utiliser les sels de tétrazolium pour surveiller la distribution spatiale de l’activité de la lactate déshydrogénase (Figure 1). Lactate déshydrogénase peut convertir pyruvate généré par la glycolyse de lactate et la réaction inverse. Activité de la lactate déshydrogénase est par conséquent un facteur déterminant de l’entrée du pyruvate dans le cycle des acides tricarboxyliques contre sa sécrétion comme le lactate. Les taux de lactate dans le sang sont souvent utilisés pour diagnostiquer un éventail de maladies, y compris le cancer8,9,10, car il peut indiquer que la maladie ou blessure a des cellules endommagées et l’enzyme a été libéré.
Il existe quatre gènes de lactate déshydrogénase : LDHA, LDHB, LDHC et LDHD11. LDHA et LDHB seraient apparus de duplication d’un début de gène LDHA12. LDH est active comme un tétramère et LDHA et LDHB peuvent former des HOMOTETRAMERES et heterotetramers entre eux. LDHA est rapporté avoir une affinité plus élevée pour le pyruvate, tandis que LDHB est rapporté pour avoir une affinité plus élevée pour le lactate et préférentiellement convertir lactate et pyruvate13. Le promoteur LDHA contient des sites de liaison pour la transcription facteurs HIF1α, cMYC et FOXM111. En outre, comme de nombreuses autres enzymes glycolytiques14,15, LDH peut être modifié par des modifications post-traductionnelles. Récepteur de facteur de croissance fibroblastique 1 peut phosphoryler LDHA à Y10, qui favorise la formation de tétramère, ou Y83, qui favorise la NADH substrat liaison16. LDHA peut également être acétylées17. Pour ces raisons, une compréhension complète de l’activité LDH exige une surveillance non seulement le taux de protéines LDH, mais aussi bien l’activité de l’enzyme.
Outre la méthode que nous présentons ici, les autres approches ont été utilisées pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase. Activité de la lactate déshydrogénase peut être surveillée par spectrophotométrie en protéines homogénéisé lysat. La génération du NADH lactate est convertie en pyruvate peut être mesurée selon l’absorbance à 340 nm, tandis que la disparition du NADH peut être surveillée comme le pyruvate est converti en lactate18. Activité de la lactate déshydrogénase a également été suivie avec l’imagerie par résonance magnétique (IRM). 13 C-pyruvate peut être administré et la conversion du pyruvate de lactate peut être surveillée comme le ratio de [1 –13C] lactate / [1 –13C] pyruvate. Élevé des ratios de [1 –13C] lactate / [1 –13C] pyruvate ont été observés dans le cancer des tissus19. Alors que les approches axées sur le MRI peuvent fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans des conditions normales et les tissus de la maladie, les méthodes n’ont pas la résolution nécessaire pour déterminer le niveau d’activité dans certaines cellules. La méthodologie proposée ici peut fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans les zones de tissus et même dans des cellules individuelles.
À l’aide de tests d’activité sur place , nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est élevée dans les cellules souches de souris peau20le follicule pileux. Nous avons également utilisé la méthode pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les cellules souches embryonnaires cultivées et trouvé que l’activité est plus élevée dans les cellules souches que la couche de conducteur. Enfin, surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les aortes de souris fraîche et observé une coloration dans les cellules musculaires lisses. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris congelées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici peut être utilisée pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase ou d’autres enzymes métaboliques qui génèrent le NADH ou le NADPH, dans différents types de cellules dans un tissu ou dans les différentes parties d’un tissu au fil du temps. Lactate déshydrogénase est une enzyme importante pour comprendre la biologie des cellules souches et de tumeurs, et la possibilité de surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans des cellules individuelles est suscep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons au HAC de National Institute de R01 de Sciences médicales générales GM081686, R01 AR070245, National Institute of (médecine générale) Sciences R01 GM0866465, l’Eli, Edythe large Centre de médecine régénérative & Stem Cell Research Collines de rose et Hal Gaba awards), Health Center/UCLA ILEC NIH Grant UL1TR000124, la leucémie Lymphoma Society, Impact l’Iris Cantor féminines octroie de la Jonsson Comprehensive Cancer Center à WEL et HAC. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli & Edythe large Centre de médecine régénérative & Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
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