Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.
Abstract
Mapping enzymatische Aktivität in Raum und Zeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Zelle Verhalten im normalgewebe und Krankheit. In Situ Stoffwechselaktivität Tests liefern Informationen über die räumliche Verteilung der metabolischen Aktivität innerhalb eines Gewebes. Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Aktivität des Enzyms Lactat Dehydrogenase direkt in Gewebeproben. Laktat-Dehydrogenase ist eine wichtige Determinante für ob konsumierten Glukose in Energie durch aerobe oder anaerobe Glykolyse umgewandelt wird. Eine Lösung mit Laktat und NAD ist ein gefrorenes Gewebe Abschnitt zur Verfügung gestellt. Zellen mit hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität konvertiert die bereitgestellten Laktat in Pyruvat, während gleichzeitig konvertieren, vorausgesetzt, Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (NAD), NADH und ein Proton, die erkannt werden können auf die Reduzierung der Basis Nitrotetrazolium blau, Formazan, die als ein blauer Niederschlag visualisiert wird. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Maus Haut. Die Anwendung dieses Protokolls, fanden wir, dass Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den ruhenden Haarfollikel Stammzellen in der Haut ist. Umsetzung des Protokolls zu embryonalen Stammzellen gezüchteten Maus zeigte höhere Färbung in kultivierten Stammzellen als Maus embryonalen Fibroblasten. Analyse der frisch isolierte Maus Aorta ergab Färbung in glatten Muskelzellen senkrecht zu der Aorta. Die Methodik zur Verfügung gestellt lässt sich räumlich zugeordnet werden die Aktivität von Enzymen, die ein Proton im gefrorenen oder frischen Gewebe erzeugen.
Introduction
Die Standorte in den Geweben, in denen Enzyme hohe oder Niedrige Aktivität haben, zu verstehen ist wichtig für Verständnis Entwicklung und Physiologie. Abschrift oder Protein Ebenen dienen oft als Surrogate für enzymatische Aktivität. Während solche Studien informativ sein können, bieten sie keine Informationen, die entscheidend für die Bestimmung einer Enzym-Aktivität, wie Post-translationalen Modifikationen, die Anwesenheit von Protein-komplexe oder das Enzym subzelluläre Lokalisation sein können. Wenn die enzymatische Aktivität direkt gemessen wird, wird es oft in homogenisierte Protein Lysates überwacht, die nicht mehr Informationen über einzelne Zellen innerhalb der Mischung oder die räumliche Verteilung der Zellen mit hoher oder niedriger Aktivität innerhalb eines Gewebes enthalten.
Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatischen Aktivität innerhalb einer Gewebeprobe. Die Methodik basiert auf früheren Studien, die zeigen, dass tetrazoliumsalz Salze verwendet werden können, um die Aktivität der Dehydrogenases, Reduktasen und oxidasen in tiefgefrorenem Gewebe1zu lokalisieren. Mit diesen Methoden wird ein wasserunlösliches Formazan gebildet, wenn eine Tetrazolium Salz2,3Protonen übertragen werden. Glukose-6-phosphat Dehydrogenase NADPH und ein Proton generiert und mit tetrazoliumsalz Aktivität erkannt wurde. Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist in Flunder Hepatozyten4, im alveolären Typ-2-Zellen der Lunge5 und Nephrone der Niere5überwacht worden. Tetrazoliumsalz Salze wurden auch zur Transketolase-Aktivität in tiefgefrorenem Gewebe6zu überwachen. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Aktivität von mehreren Dehydrogenases im gleichen Gewebe auf angrenzenden Folien7überwachen.
Wir beschreiben hier eine Methode um tetrazoliumsalz Salze verwenden, um die räumliche Verteilung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 1) zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase wandelt Pyruvat durch Glykolyse, Laktat und die umgekehrte Reaktion erzeugt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist daher eine wichtige Determinante der Pyruvat Eingang in der Tricarboxylic Säure Zyklus gegen seine Sekretion wie Laktat. Laktat-Spiegel im Blut werden oft zur diagnose einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs8,9,10, denn es signalisieren kann, dass Krankheit oder Verletzung Zellen beschädigte hat und das Enzym freigegeben wurde.
Es gibt vier Laktat-Dehydrogenase Gene: LDHA, LDHB, LDHC und LDHD11. LDHA und LDHB werden gedacht, um aus der Duplizierung von einer frühen LDHA Gen12entstanden sind. LDH ist als ein Tetramer aktiv und LDHA und LDHB bilden Homotetramers und Heterotetramers mit einander. LDHA wird berichtet, haben höheren Affinität für Pyruvat, während LDHB haben höheren Affinität für Laktat und bevorzugt Laktat in Pyruvat13konvertieren berichtet wird. Der Projektträger LDHA enthält verbindliche Aufstellungsorte für die HIF1α, cMYC FOXM1 Transkription Faktoren11. Darüber hinaus kann wie viele andere glykolytischen Enzyme14,15, LDH durch Post-translationalen Modifikationen verändert werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 phosphorylieren kann LDHA Y10, das Tetramer Bildung fördert, oder Y83, die NADH Substrat Bindung16fördert. LDHA kann auch schimmelpilzschäden17. Aus diesen Gründen erfordert ein umfassendes Verständnis der LDH-Aktivität nicht nur LDH-Protein-Ebene, sondern auch die Enzym-Aktivität sowie Überwachung.
Neben der Methode, die wir hier präsentieren, wurden andere Ansätze zur Laktat-Dehydrogenase-Aktivität zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität kann spektralphotometrisch lysate homogenisierte Protein überwacht werden. Die Erzeugung von NADH wie Laktat in Pyruvat umgewandelt gemessen werden basierend auf Absorption bei 340 nm, während das Verschwinden von NADH überwacht werden kann, wie Pyruvat in Laktat18umgewandelt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist auch mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwacht worden. 13 C-Pyruvat kann verabreicht werden, und die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat kann überwacht werden, als das Verhältnis von [1 –13C] Laktat / [1 –13C] Pyruvat. Erhöhte Verhältnisse von [1 –13C] Laktat / [1 –13C] Pyruvat in Krebs Gewebe19eingehalten worden. Während MRT-basierte Ansätze über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in Normal und Krankheit Gewebe informieren können, haben die Methoden nicht die Auflösung benötigt, um die Aktivität in bestimmten Zellen zu bestimmen. Die Methodik, die hier zur Verfügung gestellten kann Informationen über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Bereichen Gewebe und sogar in einzelnen Zellen.
Verwendung von in Situ Aktivität Assays, fanden wir, dass die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den Haarfollikel Stammzellen der Maus Haut20ist. Wir nutzten auch die Methode zu überwachen die Aktivitäten der Laktat-Dehydrogenase in kultivierten Stammzellen und fand, dass die Aktivität in den Stammzellen über die Feeder-Schicht liegt. Schließlich überwacht die Tätigkeit der Laktat-Dehydrogenase in frischen Maus Aorta und Färbung in glatten Muskelzellen beobachtet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in gefrorenen Maus Haut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, zur Überwachung der Tätigkeit des Laktat-Dehydrogenase oder andere metabolische Enzyme, die NADH oder NADPH, in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder verschiedene Teile eines Gewebes im Laufe der Zeit zu generieren. Laktat-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym für das Verständnis der Biologie der Stammzellen und Tumoren, und die Fähigkeit, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in einzelnen Zellen überwachen wird voraussichtlich wichtige Einblicke in die …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zu HAC vom nationalen Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research (finanziert. Rose Hügel und Hal Gaba awards), die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft Auswirkungen vergibt aus dem Jonsson Comprehensive Cancer Center an WEL und HAC. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
