Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Sommario

Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Abstract

Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all'interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività dell'enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all'interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell'aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all'aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l'attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.

Introduzione

Capire le posizioni all'interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l'attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l'attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell'enzima. Quando l'attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle a....

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal comitato di cura animale presso l'Università di California, Los Angeles.

1. generare diapositive della pelle del topo congelati

1. Eutanasia topi in conformità alla politica di istituzione.
   Nota: Seguire la politica istituzionale per indumenti di protezione. Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali devono essere approvati dal Comitato cura animale istituzionale.
2. Rimuovere i capelli del mouse con un trimmer peli di animali.
3. Fare delle incisioni nella pelle usando le forbici. Usando il forcipe, sollevare la pelle dal mouse. Utilizzando le forbici, tag....

Risultati

Precedentemente abbiamo segnalato risultati per analisi di attività in situ in mouse pelle²⁰. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che alti livelli di attività della deidrogenasi del lattato in cellule staminali del follicolo pilifero, alla base del follicolo di capelli quando le procedure descritte sopra sono stati seguiti. Questi risultati sono stati confermati da celle attivate la fluorescenza ordinamento della p.......

Discussione

Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all'interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funzione .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti			Per la raccolta della pelle da topi soppressi
Cryomold Tissue-tek 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	Per il congelamento della pelle di topo
Composto Tissue-Tek O.C.T. Fisher	Scientific	NC9638938	Per il montaggio di criostampi
Secchiello	Fisher Scientific	07-210-106
Ghiaccio secco
Vetrino di adesione polisinica	Fisher Scientific	12-545-78
formalina al 4%	Fisher Scientific	23-245-684	diluito in acqua
soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Fenazina metosolfato	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolio cloruro blu	Sigma-Aldrich	N6876
Litio L-lattato	Sigma-Aldrich	L2250	Substrato
37° Incubatore C (o incubatore per colture tissutali)
Brasiliano! Contromacchia	Anatech	861	Contromacchia
Mezzo di montaggio	Vector Laboratories	H-5000
Vetrini coprivetrini Fisher	Scientific	12-544D
Microscopio

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