Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Summary

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Abstract

Toewijzen van enzymatische activiteit in ruimte en tijd is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire basis van cel gedrag in normale weefsels en ziekte. In situ metabole activiteit testen kunnen informatie geven over de ruimtelijke spreiding van de metabole activiteit binnen een weefsel. Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toezicht op de activiteit van het enzym lactaat dehydrogenase rechtstreeks in weefselmonsters. Lactaat dehydrogenase is een belangrijke determinant van of verbruikte glucose worden geconverteerd naar energie via aerobe of anaerobe glycolyse. Een oplossing met lactaat en NAD wordt verstrekt aan een bevroren weefselsectie. Cellen met hoge lactaat dehydrogenase activiteit zal omzetten in de meegeleverde lactaat pyruvaat, terwijl tegelijkertijd converteren verstrekt nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) NADH en een proton, die kan worden opgespoord op basis van de vermindering van de nitrotetrazolium blauwe naar formazan, die wordt weergegeven als een blauwe neerslag. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in muis huid. Toepassing van dit protocol, vonden we dat lactaat dehydrogenase activiteit hoog in de cellen van de stam van het sluimerende haarfollikel in de huid is. Toepassing van het protocol aan gekweekte muis embryonale stamcellen, bleek hoger kleuring in gekweekte embryonale stamcellen dan muis embryonale fibroblasten. Onderzoek van vers geïsoleerde muis aorta bleek kleuring in zachte spiercellen loodrecht op de aorta. De methodologie die kan worden gebruikt om de activiteit van enzymen die het genereren van een proton in bevroren of vers weefsel ruimtelijk in kaart.

Introduction

Inzicht in de locaties binnen weefsels waarin enzymen hoge of lage activiteit hebben is essentieel voor de ontwikkeling van het begrip en fysiologie. Transcript of proteïne niveaus worden vaak gebruikt als surrogaten voor enzymatische activiteit. Hoewel dergelijke studies kunnen informatief, bieden ze geen gegevens die cruciaal worden kan voor het bepalen van een enzymactiviteit, zoals posttranslationele modificaties, de aanwezigheid van eiwitcomplexen, of van het enzym subcellular localisatie. Enzymatische activiteit rechtstreeks wordt gemeten, is het vaak gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysates die niet langer informatie over individuele cellen binnen het mengsel of de ruimtelijke spreiding van de cellen met hoge of lage activiteit binnen een weefsel bevatten.

Wij bieden hier een gedetailleerd protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit binnen een weefsel monster. De methodologie is gebaseerd op eerdere onderzoeken die aantonen dat tetrazolium zouten kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren van de activiteit van dehydrogenases, reductases en oxidasen in bevroren weefsel¹. Met deze methoden wordt een water onoplosbare formazan gevormd wanneer protonen worden overgedragen aan een tetrazolium zout^2,3. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase genereert NADPH en een proton en met tetrazolium activiteit is geconstateerd. Glucose-6-fosfaat dehydrogenase heeft gevolgd in Europese bot hepatocyten⁴, in alveolaire type 2 cellen van de longen⁵ en nephrons van de nier-⁵. Tetrazolium zouten zijn ook gebruikt om transketolase activiteit in bevroren weefsel⁶te controleren. Een soortgelijke aanpak werd onlangs gebruikt om de activiteit van meerdere dehydrogenases in de dezelfde weefsel op aangrenzende dia’s⁷te controleren.

Hier beschrijven we een methode om met behulp van tetrazolium zouten te controleren van de ruimtelijke spreiding van lactaat dehydrogenase activiteit (Figuur 1). Lactaat dehydrogenase kunt converteren pyruvaat gegenereerd door glycolyse te lactaat en de omgekeerde reactie. Lactaat dehydrogenase activiteit is bijgevolg een belangrijke determinant van pyruvaat de ingang in de tricarboxylic acid cyclus versus de secretie zoals lactaat. Lactaat niveaus in het bloed worden vaak gebruikt voor de diagnose van een aantal ziekten, waaronder kanker^8,9,10, omdat het kan signaal dat ziekte of letsel heeft beschadigde cellen en het enzym is vrijgegeven.

Er zijn vier lactaat dehydrogenase genen: LDHA, LDHB, LDHC en LDHD¹¹. LDHA en LDHB worden verondersteld te zijn ontstaan uit een vroege LDHA gen¹²dubbel. LDH is actief als een tetrameer en LDHA en LDHB kan homotetramers en heterotetramers met elkaar. LDHA wordt gemeld te hebben hogere affiniteit voor pyruvaat, terwijl LDHB aan hebben hogere affiniteit voor lactaat, en bij voorkeur converteren lactaat en pyruvaat¹³is gemeld. De promotor LDHA bevat bandplaatsen voor de HIF1α, cMYC en FOXM1 transcriptie factoren¹¹. Bovendien, zoals vele andere glycolytic enzymen^14,15, kan LDH worden gewijzigd door posttranslationele modificaties. Fibroblast groeifactor receptor 1 kan LDHA Y10, die bevordert tetrameer vorming, of Y83, die bevordert NADH substraat bindende¹⁶phosphorylate. Ook kan LDHA geacetyleerd¹⁷. Om deze redenen vereist een compleet begrip van LDH activiteit controle niet alleen LDH eiwitniveaus, maar van het enzym activiteit ook.

Naast de methode die we hier presenteren, zijn andere benaderingen gebruikt om lactaat dehydrogenase activiteit te controleren. Lactaat dehydrogenase activiteit kan spectrophotometrically worden gecontroleerd in gehomogeniseerde eiwit lysate. De generatie van NADH zoals lactaat wordt geconverteerd naar pyruvaat kan worden gemeten op basis van de absorptie bij 340 nm, terwijl de verdwijning van NADH kan worden gecontroleerd dat pyruvaat naar lactaat¹⁸is geconverteerd. Lactaat dehydrogenase activiteit heeft ook gevolgd met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). ¹³ C-pyruvaat kan worden beheerd en de omzetting van pyruvaat naar lactaat kan worden gecontroleerd als de verhouding tussen [1 –¹³C] lactaat / [1 –¹³C] pyruvaat. Verhoogde ratio’s van [1 –¹³C] lactaat / [1 –¹³C] pyruvaat zijn waargenomen in kanker weefsel¹⁹. Terwijl de MRI-gebaseerde benaderingen kunnen informatie geven over lactaat dehydrogenase activiteit in normale en ziekte weefsels, hebben de methoden niet de resolutie nodig voor het bepalen van het niveau van de activiteit in specifieke cellen. De methodologie die hier geboden kan informatie verstrekken over lactaat dehydrogenase activiteit in weefsel gebieden en zelfs in afzonderlijke cellen.

Met behulp van in situ activiteit testen, vonden we dat de activiteit van lactaat dehydrogenase hoog in de haarfollikel cellen van de stam van muis huid^{20 is}. Wij ook gebruikt de methode aan de activiteiten van lactaat dehydrogenase in gekweekte embryonale stamcellen controleren en vond dat de activiteit is hoger in de cellen van de stam dan de feeder laag. Tenslotte, wij gecontroleerd van de activiteit van lactaat dehydrogenase in verse muis aorta en waargenomen vlekken in de zachte spiercellen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor lactaat dehydrogenase bewakingsactiviteit in bevroren muis huid.

Protocol

Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Californië, Los Angeles. 1. het genereren van dia’s van bevroren muis huid Euthanaseren muizen overeenkomstig het beleid van de instelling.Opmerking: Volg institutioneel beleid voor beschermende kleding. Alle protocollen waarbij dieren moeten worden goedgekeurd door de Commissie voor de institutionele zorg van dier. Verwijderen van de muis haar met een die…

Representative Results

Resultaten voor in situ activiteit testen in muis huid20hebben we eerder gemeld. Zoals blijkt uit Figuur 3, vastgesteld we hebben dat hoge niveaus van lactaat dehydrogenase activiteit in de haarfollikel stamcellen aan de basis van de haarfollikel als hierboven de procedures beschreven werden gevolgd. Deze bevindingen werden bevestigd door fluorescentie geactiveerd cel sorteren van de huid voor de cellen van de stam van de haar…

Discussion

De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de activiteit van lactaat dehydrogenase of andere metabole enzymen die resulteren in NADH of NADPH, verschillende soorten cellen binnen een weefsel of binnen verschillende gedeelten van een weefsel na verloop van tijd te controleren. Lactaat dehydrogenase is een belangrijk enzym voor het begrip van de biologie van stamcellen en tumoren, en de mogelijkheid om lactaat dehydrogenase activiteit in afzonderlijke cellen te controleren is waarschijnlijk belangrijk inzicht verwer…

Materials

Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope