Kartlegging metabolisme: Overvåking laktat Dehydrogenase aktivitet direkte i vev

Summary

Vi beskriver en protokoll som tilordner den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet for enzymer som genererer nicotinatmide adenine dinucleotide fosfat (NAD(P)H) + H + direkte i vevsprøver.

Abstract

Kartlegging enzymatiske aktiviteten i rom og tid er avgjørende for å forstå molekylær grunnlaget for cellen atferd i normalt vev og sykdom. In situ metabolsk aktivitet analyser kan gi informasjon om den romlige fordelingen av metabolsk aktivitet innenfor en vev. Vi gir her en detaljert protokoll for å overvåke aktiviteten til enzym laktat dehydrogenase direkte i vevsprøver. Laktat dehydrogenase er en viktig determinant av om brukte glukose konverteres til energi via aerob / anaerob trening Glykolysen. En løsning som inneholder laktat og NAD gis til en frossent seksjonen. Celler med høy laktat dehydrogenase aktivitet vil konvertere den angitte laktat til pyruvate, mens samtidig konvertere gitt nikotinamid adenine dinucleotide (NAD) NADH og et proton, som kan oppdages basert på reduksjon av nitrotetrazolium blå til formazan, som er visualisert som en blå utløse. Vi beskriver en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i musen huden. Bruk denne protokollen, fant vi at laktat dehydrogenase aktivitet er høy i quiescent hårsekken stamceller innenfor huden. Bruke protokollen kulturperler mus embryonale stamceller viste høyere farging i kulturperler embryonale stamceller enn mus embryonale fibroblaster. Analyse av fersk isolert musen aorta avdekket farging i glatte muskelcellene vinkelrett aorta. Metodikken gitt kan brukes til romlig aktiviteten av enzymer som genererer et proton i frosne eller friske vevet.

Introduction

Forstå steder i vev som enzymer har høy eller lav aktivitet er avgjørende for forståelse utvikling og fysiologi. Avskrift eller protein brukes ofte som surrogater for enzymatisk aktivitet. Mens slike studier kan være informativ, gir de ikke informasjon som kan være kritiske for å bestemme et enzym aktivitet, som post-translasjonell modifikasjoner, protein komplekser, eller enzymets subcellular lokalisering. Når måles direkte enzymatisk aktivitet, er det ofte overvåket homogenisert protein lysates som ikke inneholder informasjon om individuelle celler i blandingen eller den romlige fordelingen av cellene med høy eller lav aktivitet innenfor en vev.

Vi gir her en detaljert protokoll for å kartlegge den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet innenfor en Vevsprøve. Metodene er basert på tidligere studier viser at tetrazolium salter kan brukes til å lokalisere aktiviteten til dehydrogenases, reductases og oxidases i frossent¹. Disse metodene, er en vann-uløselig formazan dannet når protoner overføres til tetrazolium salt^2,3. Glukose-6-fosfat dehydrogenase genererer NADPH og et proton, og har blitt oppdaget med tetrazolium aktivitet. Glukose-6-fosfat dehydrogenase har vært overvåket i skrubbe hepatocytter⁴alveolar type 2 cellene av lungene⁵ og nephrons nyre⁵. Tetrazolium salter har også blitt brukt til å overvåke transketolase aktivitet i frossent⁶. En lignende fremgangsmåte ble nylig brukt til å overvåke aktiviteten til flere dehydrogenases i samme vev på tilstøtende lysbilder⁷.

Her beskriver vi en metode for å bruke tetrazolium salter til å overvåke den romlige fordelingen av laktat dehydrogenase aktivitet (figur 1). Laktat dehydrogenase kan konvertere pyruvate Glykolysen til laktat, og motsatt reaksjon. Laktat dehydrogenase aktivitet er dermed en viktig determinant av pyruvate’s inngangen til tricarboxylic syre syklusen versus sekresjon som laktat. Laktat nivåer i blodet brukes ofte til å diagnostisere en rekke sykdommer, inkludert kreft^8,9,10, fordi det kan signalisere at sykdom eller skade har skadede celler og enzymet er frigitt.

Det er fire laktat dehydrogenase gener: LDHA, LDHB, LDHC og LDHD¹¹. LDHA og LDHB antas å ha oppstått fra duplisering av en tidlig LDHA gene¹². LDH er som en tetramer LDHA og LDHB kan danne homotetramers og heterotetramers med hverandre. LDHA er rapportert å ha høyere affinitet for pyruvate, mens LDHB er rapportert å ha høyere affinitet for laktat, og fortrinnsvis konvertere laktat til pyruvate¹³. LDHA selskapet inneholder bindende områder for HIF1α, cMYC og FOXM1 transkripsjon faktorer¹¹. Dessuten, som mange andre glycolytic enzymer^14,15, kan LDH endres av post-translasjonell modifikasjoner. Fibroblast vekstfaktor reseptor 1 kan phosphorylate LDHA Y10, som fremmer tetramer formasjon, eller Y83, som fremmer NADH substrat bindende¹⁶. LDHA kan også være acetylated¹⁷. For disse grunner krever en fullstendig forståelse av LDH aktivitet overvåking ikke bare LDH protein nivå, men det enzym aktivitet også.

I tillegg til metoden vi presenterer her har andre tilnærminger brukt til å overvåke laktat dehydrogenase aktivitet. Laktat dehydrogenase aktivitet kan overvåkes spektrofotometrisk homogenisert protein lysate. Generering av NADH som laktat konverteres til pyruvate kan bli målt basert på absorbans ved 340 nm, mens forsvinningen av NADH kan bli overvåket som pyruvate konverteres til laktat¹⁸. Laktat dehydrogenase aktivitet har også vært overvåket med magnetisk resonans imaging (MRI). ¹³ C-pyruvate kan administrere og konverteringen av pyruvate til laktat kan bli overvåket som forholdet mellom [1 –¹³C] laktat / [1 –¹³C] pyruvate. Forhøyet prosenter av [1 –¹³C] laktat / [1 –¹³C] pyruvate har blitt observert i kreft tissue¹⁹. Mens Mr tilnærminger kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i normal og sykdom vev, har ikke metodikkene oppløsningen måtte bestemme aktivitetsnivået i bestemte celler. Metodene som er gitt her kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i vev områder og selv i enkeltceller.

Bruker i situ aktivitet analyser, fant vi at aktiviteten til laktat dehydrogenase er høy i hårsekken stamceller musen hud²⁰. Vi brukte også metoden å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase i kulturperler embryonale stamceller og fant aktiviteten er høyere i stamceller enn mater laget. Endelig vi overvåket aktiviteten til laktat dehydrogenase i frisk musen aorta og observert farging i glatte muskelcellene. Her beskriver vi en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i frosne mus huden.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet ble godkjent av dyr omsorg komiteen ved University of California, Los Angeles. 1. Generer lysbilder frosne mus hud Euthanize mus i henhold til institusjonen personvern.Merk: Følg institusjonelle politikk for verneklær. Alle protokoller som involverer dyr må godkjennes av institusjonelle dyr omsorg komiteen. Fjerne musen er håret med en dyr hår trimmer. Lage snitt i huden med saks. Ved hjelp av pinsett, løft huden fra musen. M…

Representative Results

Vi har tidligere rapportert resultater for i situ aktivitet analyser i musen hud20. Som vist i Figur 3, observerte vi høye nivåer av laktat dehydrogenase aktivitet i hårsekken stamceller ved foten av hårsekken når fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble fulgt. Disse funn ble bekreftet av fluorescens aktivert cellen sortering av huden for hårsekken stamceller og bekrefter høy laktat dehydrogenase aktivitet i stamcelleforsk…

Discussion

Metoden beskrevet her kan brukes til å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase eller andre metabolsk enzymer som genererer NADH eller NADPH, i ulike celletyper i en vev eller i ulike deler av en vev over tid. Laktat dehydrogenase er et viktig enzym for å forstå biologi stamceller og svulster, og evnen å dataskjerm laktat dehydrogenase aktivitet i enkeltceller er sannsynlig å gi viktig innsikt i funksjonen av dette enzymet.

En viktig fordel av denne protokollen sammenlignet med andr…

Materials

Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope