Kartläggning Metabolism: Övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet direkt i vävnad
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet för enzymer som genererar nicotinatmide adenin-dinukleotidfosfat (NAD(P)H) + H + direkt i vävnadsprover.
Abstract
Mappning av enzymaktivitet i tid och rum är avgörande för att förstå den molekylära basen för cell beteende i normal vävnad och sjukdom. In situ metabolisk aktivitet analyser kan ge information om den geografiska fördelningen av metabolisk aktivitet i en vävnad. Vi ger här ett detaljerat protokoll för att övervaka aktiviteten hos enzymet laktat dehydrogenas direkt i vävnadsprover. Laktatdehydrogenas är en viktig faktor för om förbrukade glukos omvandlas till energi via aerob eller anaerob glykolys. En lösning som innehåller laktat och NAD tillhandahålls ett fryst vävnad avsnitt. Celler med hög laktatdehydrogenas aktivitet kommer att konvertera den medföljande laktat till Pyruvat, medan samtidigt konvertera som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) till NADH och en proton, vilket kan upptäckas baserat på minskning av nitrotetrazolium blå till formazan, som visualiseras som en blå fällning. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i mus hud. Tillämpning av detta protokoll, hittade vi att laktatdehydrogenas aktivitet är hög i quiescent hårsäcken stamcellerna i huden. Tillämpa protokollet till odlade mus embryonala stamceller visade högre färgning i odlade embryonala stamceller än mus embryonala fibroblaster. Analysen av nymalen isolerade mus aorta visade färgning i glatta muskelceller vinkelrätt mot aorta. Den metod som kan användas till rumsligt karta aktiviteten av enzymer som genererar en proton i fryst eller färsk vävnad.
Introduction
Förstå platser inom vävnader där enzymer har hög eller låg aktivitet är viktigt för förståelse utveckling och fysiologi. Avskrift eller protein nivåer används ofta som substitut för enzymatisk aktivitet. Sådana studier kan vara informativ, ger de inte information som kan vara avgörande för att fastställa ett enzym aktivitet, till exempel post-translationella modifieringar, förekomsten av proteinkomplex eller enzymets subcellulär lokalisering. När enzymaktiviteten mäts direkt, är det ofta övervakas i homogeniserad protein lysates som inte längre innehåller information om enskilda celler inom blandningen eller rumslig distribution av cellerna med hög eller låg aktivitet i en vävnad.
Vi erbjuder här ett detaljerat protokoll för att kartlägga den rumsliga fördelningen av enzymatisk aktivitet inom ett vävnadsprov. Metodiken bygger på tidigare studier som visar att tetrazolium salter kan användas för att lokalisera verksamhet mellan östradiol och östron, reductases och oxidases i fryst vävnad1. Med dessa metoder bildas en olöslig formazan när protoner överförs till en tetrazolium salt2,3. Glukos-6-fosfatdehydrogenas genererar NADPH och en proton, och har upptäckts med tetrazolium aktivitet. Glukos-6-fosfatdehydrogenas har övervakats i Europeiska skrubbskädda hepatocyter4, i alveolära typ 2 celler av lungorna5 och nefron av njure5. Tetrazolium salter har också använts för att övervaka transketolase aktivitet i fryst vävnad6. Ett liknande tillvägagångssätt användes nyligen till att övervaka aktiviteten hos flera mellan östradiol och östron i samma vävnaden på intilliggande bilder7.
Här beskriver vi en metod för att använda tetrazolium salter för att övervaka den rumsliga fördelningen av laktatdehydrogenas aktivitet (figur 1). Laktatdehydrogenas kan konvertera pyruvat som genereras av glykolys till laktat och omvända reaktionen. Laktatdehydrogenas aktivitet är följaktligen en viktig determinant av pyruvats hänrycka in i cykelns tricarboxylic syra kontra dess utsöndring som laktat. Laktat nivåer i blodet är ofta används för att diagnostisera ett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer8,9,10, eftersom det kan signalera att sjukdom eller skada har skadade celler och enzymet har släppts.
Det finns fyra laktatdehydrogenas gener: LDHA, LDHB, LDHC och LDHD11. LDHA och LDHB tros ha uppstått från dubblering av en tidig LDHA gen12. LDH är aktivet som en tetramer och LDHA och LDHB kan bilda homotetramers och heterotetramers med varandra. LDHA rapporteras ha högre affinitet för pyruvat, medan LDHB rapporteras ha högre affinitet för laktat, och prioriterat konvertera laktat till Pyruvat13. LDHA arrangören innehåller bindande platser för HIF1α, cMYC och FOXM1 transkription faktorer11. Dessutom, liksom många andra glycolytic enzymer14,15, kan LDH ändras av post-translationella modifieringar. Fibroblast tillväxtfaktor receptor 1 kan fosforylera LDHA på Y10, som främjar tetramer bildandet, eller Y83, som främjar NADH substrat bindande16. LDHA kan också vara acetylerade17. Av dessa anledningar kräver en fullständig förståelse av LDH aktivitet övervakning inte bara LDH proteinnivåer, men det enzymaktivitet samt.
Förutom den metod som vi presenterar här, har andra metoder använts för att övervaka laktatdehydrogenas aktivitet. Laktatdehydrogenas aktivitet kan övervakas spektrofotometriskt homogeniserad protein lysate. Generering av NADH som laktat omvandlas till Pyruvat kan mätas utifrån absorbansen vid 340 nm, medan försvinnandet av NADH kan övervakas eftersom pyruvat omvandlas till laktat18. Laktatdehydrogenas aktivitet har också följts med magnetisk resonanstomografi (MRT). 13 C-pyruvat kan administreras och omvandlingen av pyruvat till laktat kan övervakas som förhållandet mellan [1 –13C] laktat / [1 –13C] pyruvat. Förhöjda nyckeltal [1 –13C] laktat / [1 –13C] pyruvat har observerats i cancer vävnad19. Medan MRI-baserade metoder kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i normal och sjukdom vävnader, har metoder som inte den upplösning som behövs för att avgöra aktivitetsnivån i specifika celler. Den metod som anges här kan ge information om laktatdehydrogenas aktivitet i vävnad områden och även i enstaka celler.
Med i situ aktivitet analyser upptäckte vi att aktiviteten av laktatdehydrogenas är hög i hårsäcken stamcellerna mus hud20. Vi har också använt metoden att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas i odlade embryonala stamceller och hittade aktiviteten är högre i stamcellerna än feeder lagret. Slutligen, vi övervakas aktiviteten av laktatdehydrogenas i färska musen aorta och observerade färgning i glatta muskelceller. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet i frysta mus hud.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här kan användas för att övervaka aktiviteten av laktatdehydrogenas eller andra metabola enzymer som genererar NADH eller NADPH, i olika celltyper i en vävnad eller inom olika delar av en vävnad över tid. Laktat dehydrogenas är ett enzym som är viktigt för att förstå biologin av stamceller och tumörer, och förmågan att följa laktatdehydrogenas i enskilda celler är sannolikt att ge viktiga insikter i funktionen av detta enzym.
En viktig fördel med detta …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC var Milton E. Cassel lärd av Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Detta arbete finansierades genom bidrag till HAC från nationella institutet av allmänna medicinska vetenskaper R01 GM081686, R01 AR070245, nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper R01 GM0866465, Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller ( Rose Hills och Hal Gaba awards), Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, föreningen leukemi lymfom, inverkan utmärkelser från Jonsson omfattande Cancer Center WEL och HAC. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. HAC är medlem av Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & forskning på stamceller, UCLA molekylärbiologi Institutet och UCLA bioinformatik enhetsövergripande programmet.
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
Riferimenti
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
