Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.
In een breed scala aan fundamentele cel processen, zoals membraan mensenhandel en apoptosis, optreden celmembraan vorm overgangen gelijktijdig met lokale variaties in calcium ion concentratie. De belangrijkste moleculaire componenten die bij deze processen betrokken zijn geconstateerd; de specifieke interactie tussen calcium ion verlopen en de lipiden in het celmembraan is echter veel minder bekend, vooral vanwege de complexe aard van de biologische cellen en het moeilijk van observatie regelingen. Om deze kloof, is een synthetische benadering succesvol geïmplementeerd te onthullen het gelokaliseerde effect van calciumionen op celmembraan nabootsers. Tot oprichting van een nagebootst om te lijken op de voorwaarden binnen een cel is een severalfold probleem. Eerst, een voldoende biomimetische model met de juiste afmetingen en membraan samenstelling is vereist voor het vastleggen van de fysische eigenschappen van de cellen. Ten tweede, een micromanipulation setup is moest leveren een kleine hoeveelheid calciumionen naar de locatie van een bepaald membraan. Tot slot is een observatie-regeling vereist om te detecteren en registreren van de reactie van het lipide membraan op de externe stimulatie. Dit artikel biedt een gedetailleerde biomimetische benadering voor het bestuderen van de calcium ion-membraan interactie, waar een lipide vesikel systeem, bestaande uit een gigantische unilamellar blaasje (GUV) aangesloten op een multilamellar blaasje (MLV), wordt blootgesteld aan een gelokaliseerde calcium kleurovergang gevormd met behulp van een systeem van microinjection. De dynamiek van de Ionische invloed op het membraan werden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie en opgenomen op video framesnelheden. Als gevolg van de membraan stimulatie, zeer gebogen membraan buisvormige uitsteeksels (MTPs) gevormd binnen de GUV, uit de buurt van het membraan gericht. De beschreven aanpak induceert de verbouwing van het lipide membraan en MTP productie in een volledig contactloze en gecontroleerde manier. Deze benadering introduceert een middel om de adresgegevens van calcium ion-membraan interacties, bieden nieuwe wegen om te bestuderen van de mechanismen van het omvormen van de celmembraan.
De rol van calciumionen binnen biologische processen, specifiek hun betrokkenheid bij signalering, celdeling en membraan fusion, is de focus van vele studies mechanistische1. De intracellulaire cytoplasmatische calcium ion concentratie is over de volgorde van 100 nM, terwijl het calcium in organellen, zoals endoplasmatisch reticulum, secretoire blaasjes en mitochondriën, bereiken niveaus tot tientallen millimolars in concentratie. Dit leidt tot steile calcium ion concentratie verloop ordes van grootte over intracellulaire membranen2,3,4,5,6,7,8 ,9. De extracellulaire calcium ion niveau is ongeveer 2 mM en vandaar, de variaties van calcium ion concentratie treden bij zowel de extracellulaire en intracellulaire niveaus. Bovendien, de recente studies bewijzen dat ion van intracellulair calcium signalering gebeurtenissen en neuronale activiteit kan optreden onder de voorwaarden van lokale fluctuaties van extracellulaire calcium ion concentraties, het belang van gesynchroniseerd intra- en extracellulaire calcium ion variaties10.
Gericht op het begrijpen van de interactie tussen calciumionen en biologische membranen, een synthetische benadering waarbij native celmembranen worden vervangen met lipide dubbelgelaagde blaasjes met succes is uitgevoerd. Bloot blaasjes calcium ion oplossingen leidt tot veranderingen in lipide hoofd groepen en koolwaterstof keten verpakking, verhoogde membraan spanning, en vesikel aggregatie, evenals de segregatie van lipiden en membraan fase overgang11,12 ,13,14,15,16. De eigenschappen van het lipide membraan bij blootstelling aan calciumionen zijn onderzocht met behulp van dergelijke experimentele technieken als X-ray, 1H-NMR en spectroscopische of thermodynamische studies11,16, 17 , 18. in deze studies, de membraan samenstelling is vaak afgestemd om te lijken op inheemse celmembranen en bevat deze fysiologische lipiden als fosfatidylserine (PS), dunlaag (PC) en phosphatidylethanolamine (PE). PS is vooral belangrijk in kunstmatige vesikel voorbereiding want het is een essentieel onderdeel in veel cellulaire processen zoals intracellulaire membraan mensenhandel exocytose en apoptosis19,20.
De grootte van gesynthetiseerde lipide blaasjes varieert vaak van nanometer tot enkele micrometers. Verschillende vesikel preparaten, gigantische unilamellar blaasjes (GUVs), die behoren tot verschillende tot tientallen micrometers diameter, van bijzonder belang zijn vanwege hun relatief grote omvang, vertonen met de afmetingen van individuele cellen21 , 22 , 23. het beschikbaar oppervlak van de GUVs kan het effect van lokale chemische verlopen op membraan biofysische eigenschappen worden bestudeerd. Door slechts een deel van het oppervlak van de membraan op de externe prikkels bloot te leggen, kunnen de membraan dynamiek nauwer worden onderzocht. Het heeft bijvoorbeeld aangetoond dat gelokaliseerde toepassing van chemische of pH verlopen op het oppervlak van GUVs leidt tot de vorming van buisvormige uitsteeksels, die niet werden waargenomen bij bulk blootstelling24,25. De waargenomen verschillen in gedrag van de membraan bellen voor verdere ontwikkeling van de methode van single-vesikel ondervraging regelingen te krijgen sommige inzicht in de mechanismen van het remodelleren van de celmembraan.
Voortbouwend op de methoden van microinjection en micromanipulation uit de vroege jaren 190026,27, in het kader van meer recente ontwikkelingen op het gebied van single-vesikel manipulatie regelingen van de 2000s23,28 , dit artikel presenteert een aanpak in welke membraan remodelleren en vorming van membraan buisvormige uitsteeksels (MTPs) in het membraan van de GUV worden gegenereerd in reactie op lokale toepassing van calciumionen.
Onze aanpak maakt gebruik van een blaasje complex bestaande uit een GUV aangesloten op een multilamellar blaasje (MLV) als een biomimetische membraan modelsysteem (figuur 1A). De MLV is vereist als een lipide reservoir voor het complex lipide materiaal aan de GUV tijdens de blootstelling aan een calcium ion verloop opgeeft. Deze aansluiting kunt u het complex te compenseren voor de toename van de membraan spanning tijdens geïnduceerde remodelleren en vorm van de overgang van het membraan GUV lipiden voorzien MTP groei. Bovendien, de MLV vergemakkelijkt de oppervlakte immobilisatie, omdat de massa groter is vergeleken met die van de GUV. De GUV-MLV-complexen, wanneer geïmmobiliseerd op een stevige ondergrond, is eerder hebt gebruikt voor het produceren van nanotube-vesikel netwerken, polymeer-membraan interactie te bestuderen, en het nabootsen van de late stadia van exocytose29,30, 31,32,33.
Eerdere protocollen gebruikt soja polar lipide extract (SPE) om te bereiden GUV-MLV complexen28. De SPE bestaat uit een mengsel van fosfolipiden waarin PC (45,7%), PE (22,1%), phosphatidylinositol (PI, 18,4%), phosphatidic zuur (PA, 6,9%), en een mengsel van andere lipiden (6,9%). In ons protocol hierin, is het SPE-mengsel doped met 20% van de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumzout) (DOPS) om na te bootsen de innerlijke folder van de celmembraan van de plasma. Een extra 1% van ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) wordt gebruikt om de lipide dubbelgelaagde zodat toezicht op de membraan remodelleren met behulp van fluorescentie microscopie vlek. De GUVs hebben van lipide-symmetrische compositie over het dubbelgelaagde en lokaal blootgesteld aan 5 mM concentraties van de calcium chloride (CaCl2). Dergelijke experimentele omstandigheden, met een verhoogde calcium ion concentratie, nabootsen ook de bijsluiter van de buitenmembraan van apoptotic cellen, waar de PS-moleculen uitgedrukt34 zijn. De vorming van de GUV-MLV-complexen vereist het gebruik van een gemodificeerde rehydratie-uitdroging methode die oorspronkelijk is ontwikkeld door Criado en Keller35. Het blaasje voorbereiding protocol bevat de vorming van een droge lipide-laag, die vervolgens wordt gebruikt om kleine blaasjes in oplossing vormen. Deze oplossing is vervolgens gedehydrateerde en gerehydrateerd te vormen van de uiteindelijke GUV-MLV-complexen. Figuur 2A -D illustreert de belangrijkste stappen ter voorbereiding van een typische GUV-MLV-complex.
Nadat de vesikel voorbereiding is afgerond en het blaasje complex is geïmmobiliseerd op het glas-substraat, wordt de microinjection techniek gebruikt voor het leveren van kleine hoeveelheden van calciumionen aan het buitenste de bijsluiter van de GUV door middel van een open-tip glas micropipet. De stroom van calcium oplossing uit de tip genereert een gelokaliseerde calcium ion kleurovergang aan de GUV membraan oppervlak, wat leidt tot membraan remodelleren en generatie van de MTPs. De MTPs zijn weg van de bron van calcium ion georiënteerd en groeien binnen de GUV. Deze formatie MTP rechtstreeks kan worden gecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie en opgenomen met behulp van een digitale camera. Figuur 3 toont de experimentele opzet gebruikt voor de productie van het remodelleren van de membraan. De vorming van de MTPs (figuur 2E en Figuur 4) in dit protocol toont een contrasterende resultaat calcium ion blootstelling experimenten uitgevoerd in bulk volume voorwaarden. Omstandigheden van de bulk, de GUVs scheuren en vormen van membraan patches die zich houden aan het oppervlak van glas25kunnen worden waargenomen.
Verdere details over de vorming van de GUV-MLV-complexen, evenals de procedure voor het uitvoeren van de microinjection van calciumionen, worden uitgelegd in dit artikel. De protocollen zijn grotendeels gericht op calcium ion microinjection; Deze benadering kan echter eenvoudig worden aangepast voor gebruik bij het bestuderen van de membraan reacties als gevolg van de lokale blootstelling aan andere ionen of eiwitten. Bovendien is de samenstelling van de blaasjes kan worden afgestemd om te isoleren van de lipide onderdeel rollen in het proces van het remodelleren van het membraan. Het gepresenteerde protocol vereist geen verfijnde apparatuur voor de productie van de GUV-MLV-complexen en wordt gekenmerkt door een hoge graad van reproduceerbaarheid.
Biomimetische cel systemen kunnen voor de studie van membraan gedrag bij de blootstelling aan externe prikkels zoals ionen, eiwitten of nanodeeltjes. GUVs, wordt een dergelijk model, kunnen inspelen op veranderingen in de chemische omgeving door een aanpassing van hun vorm, waarbij vaak de vorming van buisvormige structuren en invaginations24,41,42,43 .
Dit artikel biedt een aanpak voor het genereren van MTPs in een contactloze wijze via het remodelleren van het oppervlak van de GUV na gelokaliseerde injectie van calciumionen aan het GUV-oppervlak. Het protocol beschrijft de voorbereiding van het GUV-MLV-complex, die een plasma celmembraan, evenals bootst hoe te een microinjection techniek voor het genereren van calcium ion verlopen dichtbij de GUV aan formulier MTPs oppervlakte. De meerderheid van de eerdere experimentele studies die calcium ion-membraan interacties gericht blootgesteld lipide blaasjes om bulk calcium ion concentratie14,17. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, zo’n bulk blootstelling kan leiden tot een reactie van de verschillende membraan met buisvormige uitsteeksels gevormd25.
De vorming van de GUV-MLV-complexen is vrij eenvoudig en vereist alleen standaard laboratoriumapparatuur, zoals een roterende verdamper, ultrasoonbad en vacuüm exsiccator. Toch zijn er verschillende kritische stappen te overwegen tijdens de voorbereiding van het vesikel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de uitdroging van de blaasjes voltooid (tijdens stap 2.3 van het protocol is) en een droge circulaire lipide-film met slechts een kleine hoeveelheid zout kristallen op het oppervlak van het glas cover slip wordt gevormd. Tijdens het experiment, zorgvuldige behandeling van het vesikel-oplossing, met behulp van de stockoplossing van het verse lipide in chloroform, evenals verse HEPES-buffer, is essentieel voor succesvolle voorbereiding van de GUV-MLV-complexen. Bovendien, veilige gehechtheid van het GUV-MLV-complex aan de glazen cover slip oppervlak is cruciaal voor micromanipulation en microinjection. Om te bevestigen voldoende hechting van de GUV-MLV complex, de micropipet (zonder injectie stroom) kan worden gebruikt om Duw voorzichtig tegen de GUV-oppervlak. Een stevig zelfklevend blaasje zal niet glijden langs het oppervlak na direct fysiek contact. Omdat de experimenten zijn uitgevoerd in een open buffer druppel, die kan worden ondervraagd voor enkele uren, moet rekening worden gehouden met verdamping. Verdamping van de buffer druppel zal het veranderen van de osmotische voorwaarden, die kon beïnvloeden en destabiliseren de blaasjes. Om te herstellen osmotische voorwaarden, weer periodieke toevoeging van zuiver water aan het monster om te herstellen van de oorspronkelijke volume in het systeem homeostase.
Als u de lipiden membraan samenstelling wijzigt, is het van cruciaal belang dat de blaasjes worden geproduceerd in de vorm van een GUV-MLV-complex, omdat de MLV zorgt voor de overdracht van het lipide-materiaal naar de GUV tijdens het membraan hervormen. Eerdere studies hebben aangetoond dat de bestanddelen van het mengsel van de SPE te vervangen door zuivere lipiden, of het toevoegen van 5-30% van cholesterol, ook GUV-MLV complexvorming28,44 voorziet. De meerderheid van de voorbereide GUVs zijn unilamellar45.
Bovendien, bij het testen van andere divalente kationen, zoals magnesium ionen, de vorming van de MTPs zwaar afhankelijk van de aanwezigheid van negatief geladen DOPS in het lipide-mengsel. Zonder DOPS vormen de MTPs geen in de blaasjes beschreven in dit protocol. Ook monovalent kationen, zoals kalium en natrium, niet leiden tot de vorming van MTPs, zelfs in DOPS-bevattende blaasjes25.
Naast de kritische stappen wat betreft voorbereiding en manipulatie van de GUVs zijn er verschillende belangrijke factoren te overwegen tijdens de procedure microinjection. De succesvolle microinjection van calciumionen is sterk afhankelijk van goed functionerende glas micropipetten, die bereid zijn op de dag van het experiment. Er zijn verschillende factoren die kunnen zorgen dat de micropipet kuren te vertonen. Een gemeenschappelijke reden is een verstopte tip-opening. Lipide-kleine deeltjes, die zijn bijproducten van de voorbereiding van het vesikel zijn verspreid in de oplossing en hebben de neiging vast te houden aan het uiteinde van de micropipet, waardoor het genereren van een verstopping. Reinigen van de pipet tip gebeurt best door omhoog tillen van het vesikel oplossing en brengen het terug dichtbij de GUV-oppervlak. Het gebruik van de functie van de blow-out van de microinjection pomp moet worden vermeden omdat het resulteert in enorme injectie van calciumionen in de oplossing van de bulk. Bovendien, kleine luchtbellen binnen de micropipet in de val gelokt voorkomen juiste microinjection, in dat geval de micropipet moet worden vervangen door een nieuwe. Tip breuk kan aanzienlijk worden geminimaliseerd door het plaatsen van de experimentele opstelling op een trillingsdemping tabel om te minimaliseren van tip oscillaties.
Bovendien moet zorg worden genomen bij het kiezen van een observatie-schema aan photobleaching minimaliseren terwijl het verkrijgen van de beste tijd-opgelost-beelden. Breed-gebied laser-geïnduceerde fluorescentie microscopie werd gebruikt in dit protocol, omdat het voorziet in een relatief hoge beeldsnelheid voor acquisitie op een diepte van objectieve beperkt sonde. Bovendien zorgt gebruik van omgekeerde microscopie voor gelijktijdige microinjection en observatie van de lipide blaasjes en MTPs.
Een van de belangrijkste beperkingen van de onderhavige methode is de eis van uitgebreide handmatige werk en voldoende micromanipulation vaardigheden. Omdat de complexen worden gevormd door een spontane zwelling proces, kan niet de grootte van de GUVs en de MLVs worden gecontroleerd. Dit protocol staat bovendien geen voor controle van de spanning van de membraan van de bereid GUV-MLV-complexen, die wellicht noodzakelijk om te verzamelen aanvullende gegevens met betrekking tot het remodelleren van de membraan. De GUVs zijn verbonden met de MLVs met het laatste gegevensverstrekkende lipide-materiaal voor de aanzienlijke groei van de MTPs tot op zekere hoogte dat zou onmogelijk zijn om uitsluitend gebruik te maken van het membraan van de GUVs beschikbaar. De MLVs ook bijdragen aan het verlagen van de laterale oppervlaktespanning variaties binnen de GUV-MLV complexe44, die de pogingen om de spanning van het vesikel regelen met behulp van micropipet streven zou bemoeilijken. Dit GUV-MLV-gebaseerde model biedt een lagere spanning die beter de regimes van de spanning in cellulaire membraan structuren verbonden met membraan stuwmeren, zoals membraan plooien en invaginations46gevonden bootst. Op hetzelfde moment, kan de micropipet aspiratie techniek met succes worden toegepast om te bepalen van de spanning van de membraan in één GUVs. Bijvoorbeeld verstrekt het werk van Graber et al. details over de vorming van de tubulaire invaginations van de membraan in één GUVs bij binding van calciumionen aan het membraan op bulk voorwaarden gevarieerde spanning regimes €40. Tot slot, de vergelijking van het membraan gedrag op zowel lokale als bulk blootstelling aan calcium vereist betere controle van de membraan hechting aan het oppervlak, dat buiten het bestek van dit protocol valt.
Samenvattend, zorgt de voorgestelde techniek voor contactloze membraan remodelleren en vorming van MTPs bij gelokaliseerde stimulatie met calciumionen. Toekomstige toepassingen van deze methode center op de vertaling van synthetische vesikel systemen naar inheemse biologische membranen, zoals de cel blebs. De voorgestelde methode kan dan worden samengebouwd met andere eencellige ondervraging regelingen, zoals patch-clamp of micro-elektrode amperometry, gecombineerd met gelokaliseerde verwarming strategieën31,47,48. Testen van het effect van andere ionen of moleculen is eenvoudig en gaat gewoon de calciumionen te vervangen met de moleculen van belang. Bovendien, complexe synthetische lipide blaasjes kunnen worden geproduceerd door membraan functionalization met transmembraan eiwitten, die ons begrip van de biofysica van cel omvormen en celmembraan dynamiek gekoppeld sensing van lokale kan uitbreiden chemische verlopen. Laatste, maar daarom niet minder belangrijk, contactloze stimulatie van het lipide membraan kan ook vertaald worden naar polymere zachte materie systemen, het aanbieden van een basis voor een nieuwe contactloze manipulatie-platform.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |