Presentamos una técnica de micromanipulación sin contacto de vesículas, con gradientes del ion de calcio localizada. Microinyección de una solución de iones de calcio, en las cercanías de una vesícula lipídica gigante, se utiliza para remodelar la membrana lipídica, dando como resultado la producción de protuberancias tubulares de membrana.
En una amplia variedad de procesos celulares fundamentales, como tráfico de membrana y apoptosis, transiciones de forma de membrana de la célula ocurren simultáneamente con variaciones locales en la concentración de iones de calcio. Se han identificado los principales componentes moleculares implicados en estos procesos; sin embargo, la interacción específica entre gradientes de iones de calcio y lípidos en la membrana celular es mucho menos conocida, principalmente debido a la naturaleza compleja de las células biológicas y la dificultad de los esquemas de observación. Para cerrar esta brecha, un enfoque sintético es aplicado con éxito para revelar el efecto localizado de iones calcio en imitadores de la membrana de la célula. El establecimiento de un imitador para asemejarse a las condiciones dentro de una célula es un problema repetido. En primer lugar, un modelo adecuado biomiméticos con adecuadas dimensiones y composición de la membrana es necesaria para captar las propiedades físicas de las células. En segundo lugar, se necesita una configuración de micromanipulación para entregar una pequeña cantidad de iones de calcio a una ubicación particular de la membrana. Por último, un esquema de observación es necesaria para detectar y registrar la respuesta de la membrana lipídica a la estimulación externa. Este artículo ofrece un enfoque biomimético detallada para el estudio de la interacción de membrana de iones calcio, donde un sistema de vesícula lipídica, formado por una vesícula unilaminar gigante (GUV) conectada a una vesícula multilamellar (MLV), está expuesto a un calcio localizado gradiente formado mediante un sistema de microinyección. La dinámica de la influencia iónica en la membrana se observó mediante microscopía de fluorescencia y registrada en las tasas de fotogramas de vídeo. Como resultado de la estimulación de la membrana, muy curvado salientes tubulares de membrana (MTPs) formadas en el interior el GUV, orientada a la membrana. El enfoque descrito induce la remodelación de la membrana lipídica y la producción de MTP en forma totalmente controlada y sin contacto. Este enfoque introduce un medio para abordar los detalles de las interacciones de membrana de iones calcio, proporcionando nuevas vías para estudiar los mecanismos de remodelación de la membrana de la célula.
El papel de los iones de calcio dentro de los procesos biológicos, específicamente su participación en la señalización, la división celular y fusión de la membrana, es el foco de muchos estudios mecanísticos1. La concentración del ion calcio citoplasmático intracelular es del orden de 100 nM, mientras que el calcio en orgánulos como el retículo endoplasmático, vesículas secretoras y mitocondrias, alcanzar niveles de hasta decenas de millimolars en la concentración. Esto crea iones calcio escarpado gradiente de la concentración órdenes de la magnitud a través de las membranas intracelulares2,3,4,5,6,7,8 ,9. El nivel de iones de calcio extracelular es de alrededor de 2 mM y por lo tanto, las variaciones de concentración de iones de calcio se producen a nivel intracelular y extracelular. Además, recientes estudios proporcionan evidencia que el ion calcio intracelular señalización de eventos y la actividad neuronal puede ocurrir bajo condiciones de fluctuaciones locales de concentraciones del ion de calcio extracelular, lo que indica la importancia de la sincronización intra – y extracelular calcio iones variaciones10.
Con el objetivo de comprender la interacción entre los iones de calcio y las membranas biológicas, un enfoque sintético en el que nativos de las membranas celulares son reemplazadas con vesículas bicapa de lípidos se ha implementado con éxito. Exponer las vesículas a las soluciones de iones de calcio conduce a cambios en los principales grupos de lípidos y embalaje de cadena de hidrocarburos, membrana mayor tensión y agregación de vesícula, así como la segregación de los lípidos y membrana de fase de la transición11,12 ,13,14,15,16. Se han investigado las propiedades de las membranas de lípidos sobre la exposición a los iones calcio utilizando técnicas experimentales como rayos x, 1H-RMN y estudios espectroscópicos o termodinámicas11,16, 17 , 18. en estos estudios, la composición de la membrana se templa a menudo para asemejarse a los nativos de las membranas celulares y contiene tales lípidos fisiológicos como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilserina (PS). PS es especialmente importante en la preparación de vesículas artificiales porque es un componente esencial en muchos procesos celulares, incluyendo tráfico de membrana intracelular, exocitosis y apoptosis19,20.
El tamaño de las vesículas de lípidos sintetizados a menudo va de nanómetros a varios micrómetros. Entre diferentes vesículas, las vesículas gigantes unilaminar (2.fino), que son varias decenas de micrómetros de diámetro, son de particular importancia debido a su tamaño relativamente grande, muy parecidas a las dimensiones del individuo células21 , 22 , 23. la superficie disponible de la 2.fino permite el efecto de los gradientes químicos locales en propiedades biofísicas de la membrana a estudiar. Por exponer sólo una parte de la superficie de la membrana a los estímulos externos, se puede investigar más de cerca la dinámica de la membrana. Por ejemplo, se ha demostrado que la aplicación localizada de gradientes químicos o pH en la superficie del 2.fino conduce a la formación de protuberancias tubulares, que no se observaron en mayor exposición24,25. Las diferencias observadas en el comportamiento de la membrana llaman para más desarrollo de esquemas de vesícula simple interrogatorio a ganar algunas penetraciones en los mecanismos de remodelación de la membrana de la célula.
Sobre la base de los métodos de microinyección y micromanipulación del temprano 1900s26,27, en relación con los avances más recientes de sistemas de manipulación simple vesícula desde el 2000s23,28 , este artículo presenta un enfoque en que la membrana remodelación y formación de protuberancias tubulares de membrana (MTPs) en la membrana GUV son generados en respuesta a la aplicación local de iones de calcio.
Nuestro enfoque utiliza una vesícula compleja que consta de un GUV conectado a una vesícula multilamellar (MLV) como un sistema biomimético de modelo de membrana (figura 1A). El MLV es requerida como un depósito de lípidos para el complejo suministrar material de lípidos para el GUV durante la exposición a un gradiente de iones de calcio. Esta conexión permite que el complejo compensar el aumento en la tensión de la membrana durante la remodelación inducida y forma la transición de la membrana GUV y proporcionan lípidos para crecimiento de MTP. Además, el MLV facilita la inmovilización superficial porque su masa es mayor en comparación con el GUV. Los complejos de GUV-MLV, cuando inmovilizado sobre un sustrato sólido, se han utilizado previamente para producir redes de nanotubos-vesícula, estudiando la interacción de membrana polimérica y mímico las últimas etapas de exocitosis29,30, 31,32,33.
Protocolos anteriores utilizaron extracto lípido polar de soja (SPE) para preparar complejos de GUV-MLV28. La SPE consiste en una mezcla de fosfolípidos que incluyen PC (45.7%), PE (22,1%), fosfatidilinositol (PI, 18.4%), ácido fosfatídico (PA, 6,9%) y una mezcla de otros lípidos (6.9%). En nuestro protocolo adjunto, la mezcla SPE es dopada con 20% de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sal sódica) (DOPS) para imitar el prospecto interno de la membrana plasmática de la célula. Un 1% de ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-droga) se utiliza para manchar el bilayer del lípido para habilitar la supervisión de la remodelación de la membrana utilizando microscopía de fluorescencia. El 2.fino tiene composición de lípido simétrico a través de la bicapa y localmente está expuesto a concentraciones de 5 mM de cloruro de calcio (CaCl2). Estas condiciones experimentales, con una concentración de ion calcio elevado, también imitan el folleto de la membrana externa de las células apoptóticas, donde las moléculas PS son expresados34. La formación de los complejos de GUV-MLV requiere el uso de un método de deshidratación de rehidratación modificado inicialmente desarrollado por Criado y Keller35. El protocolo de preparación de vesícula incluye la formación de una capa de lípido seco, que se utiliza para formar pequeñas vesículas en la solución. Esta solución es entonces deshidratada y rehidratada para formar los complejos de GUV-MLV finales. Figura 2A -D muestra los pasos principales para la preparación de un típico complejo de GUV-MLV.
Después de completa la preparación de la vesícula y la vesícula complejo es inmovilizada en el sustrato de vidrio, se utiliza la técnica de microinyección entregar pequeñas cantidades de iones calcio al prospecto externo del GUV a través de una micropipeta de vidrio de punta abierta. El flujo de la solución de calcio fuera de la punta genera un gradiente de iones de calcio localizada en la superficie de la membrana GUV, conduce a la remodelación de la membrana y la generación de las MTPs. El MTPs se orientan de la fuente de iones de calcio y crecen dentro del GUV. Esta formación de MTP puede controlarse directamente mediante microscopía de fluorescencia y grabado con una cámara digital. La figura 3 muestra el montaje experimental utilizado para la producción de la remodelación de la membrana. La formación de las MTPs (Figura 2E y figura 4) en este protocolo muestra un contrastante resultado calcio ion exposición experimentos llevados a cabo en condiciones de volumen a granel. Condiciones a granel, el 2.fino rompen y forma parches de membrana que se observa a adherirse a la superficie de vidrio25.
Más información en la formación de los complejos de GUV-MLV, así como el procedimiento para realizar la microinyección de iones calcio, son explicados en este artículo. Los protocolos se centran en gran parte en microinyección de iones de calcio; sin embargo, este enfoque puede modificarse fácilmente para su uso en el estudio de las respuestas de membrana debido a la exposición local a otros iones o proteínas. Además, la composición de las vesículas puede ser afinada para aislar las funciones de componente lipídico en el proceso de remodelación de la membrana. El protocolo presentado no requiere ningún equipo sofisticado para producir los complejos de GUV-MLV y se caracteriza por un alto grado de reproducibilidad.
Biomiméticos celular sistemas permiten el estudio del comportamiento de la membrana sobre la exposición a los estímulos externos tales como los iones, proteínas o nanopartículas. 2.fino, siendo un modelo, puede responder a alteraciones en el ambiente químico ajustando su forma, que a menudo involucra la formación de tubulares estructuras e invaginaciones24,41,42,43 .
Este artículo ofrece un acercamiento para generar MTPs de una manera sin contacto a través de la remodelación de la superficie GUV a inyección localizada de iones de calcio en la superficie GUV. El protocolo describe la preparación del complejo GUV-MLV, que imita una membrana de células plasmáticas, así como emplear una técnica de microinyección para generar calcio gradientes del ion cerca el GUV superficial para formar MTPs. La mayoría de los estudios experimentales previos que aborda las interacciones membrana-iones de calcio expuesto vesículas de lípidos a granel calcio iónico concentración14,17. Dependiendo de las condiciones experimentales, tal exposición a granel puede resultar en una respuesta diferente de la membrana sin protuberancias tubulares formadas25.
La formación de los complejos de GUV-MLV es bastante sencilla y sólo requiere equipo normal de laboratorio, como un evaporador rotatorio, baño ultrasónico, desecador de vacío. Sin embargo, existen varios pasos críticos a tener en cuenta durante la preparación de la vesícula. Es importante asegurarse de que la deshidratación de las vesículas es completada (durante el paso 2.3 del Protocolo) y se forma una película seca lípidos circular que contiene sólo una pequeña cantidad de cristales de sal en la superficie de la hoja de cubierta de vidrio. Durante el experimento, cuidadoso manejo de la solución de la vesícula, usando solución fresca del lípido en cloroformo así como fresco tampón HEPES, es esencial para la exitosa preparación de los complejos de GUV-MLV. Además, una fijación segura del GUV-MLV complejo a la superficie del cubreobjetos de vidrio es crucial para la micromanipulación y microinyección. Para confirmar la adecuada adherencia del GUV-MLV complejo, la micropipeta (sin flujo de inyección) puede utilizarse para empujar suavemente contra la superficie GUV. Una vesícula firmemente adherida no se deslizará a lo largo de la superficie en contacto físico directo. Porque los experimentos se realizan en una gota de tampón abierto, que puede ser interrogado durante varias horas, evaporación debe tenerse en cuenta. Evaporación de la gota del buffer cambia las condiciones osmóticas, que podrían afectar y desestabilizar las vesículas. Para restaurar las condiciones osmóticas, adición periódica de agua pura a la muestra para restaurar el volumen original devuelve el sistema a la homeostasis.
Cuando se modifica la composición lipídica de la membrana, es crucial que las vesículas se producen en la forma de un complejo de GUV-MLV porque el MLV permite transferir el material lipídico al GUV durante la remodelación de la membrana. Estudios anteriores han demostrado que SOSTITUCIÓN de los componentes de la mezcla SPE con lípidos puros o adición de 5-30% de colesterol, también permite la formación de complejos de GUV-MLV28,44. La mayoría de lo preparado 2.fino son propiedades45.
Además, al probar otros cationes divalentes, como los iones de magnesio, la formación de las MTPs mucho depende de la presencia de DOPS negativamente cargada en la mezcla de lípidos. Sin DOPS, el MTPs no forman en las vesículas que se describe en este protocolo. También, los cationes monovalentes, como el potasio y sodio, no dan lugar en la formación del MTPs, incluso en las vesículas que contienen DOPS25.
Además de los pasos críticos en cuanto a la preparación y manipulación de la 2.fino, hay varios factores importantes a considerar durante el proceso de microinyección. La exitosa microinyección de los iones del calcio depende pesadamente funcionamiento correctamente cristal micropipetas, que se preparan en el día del experimento. Hay varios factores que podrían causar la micropipeta al mal funcionamiento. Una razón común es una abertura de la punta tapada. Las partículas pequeñas de lípidos, que son subproductos de la preparación de la vesícula, se dispersan en la solución y tienden a adherirse a la punta de la micropipeta, generando una obstrucción. Limpieza de la punta se hace mejor levantando de la solución de la vesícula y colocando nuevamente cerca de la superficie GUV. El uso de la función de expulsión de la bomba de microinyección debe evitarse debido a la inyección masiva de iones calcio en la solución a granel. Además, pequeñas burbujas de aire atrapadas dentro de la micropipeta previenen microinyección adecuado, en el cual caso la micropipeta debe reemplazarse por uno nuevo. Rotura de la punta puede minimizarse significativamente colocando el montaje experimental en una tabla de amortiguación de la vibración para reducir al mínimo las oscilaciones de la punta.
Además, cuidado debe ser tomado al elegir un esquema de observación, para minimizar el fotoblanqueo y obtener las mejores imágenes de tiempo resuelto. Microscopía de fluorescencia inducida por láser de gran campo fue utilizado en este protocolo porque permite una tasa de adquisición de imagen relativamente altas a una profundidad de sonda limitada objetiva. Además, el uso de microscopía invertida permite simultánea microinyección y observación de las vesículas de lípidos y MTPs.
Una de las principales limitaciones del método presentado es el requerimiento de trabajo manual extenso y suficientes habilidades de micromanipulación. Porque los complejos se forman a través de un proceso de inflamación espontáneo, no se puede controlar el tamaño de la 2.fino y proveedores de servicios multilingües. Además, este Protocolo no permite para el control de la tensión de la membrana de los preparados complejos GUV-MLV, que puede ser necesario recoger información adicional con respecto a la remodelación de la membrana. El 2.fino está conectado a los proveedores de servicios multilingües con el último material lípido provee para el crecimiento sustancial de las MTPs a tal punto que sería imposible de lograr utilizando únicamente la membrana de la 2.fino. Los proveedores de servicios multilingües también contribuyen a reducir las variaciones de tensión de superficie lateral dentro del GUV-MLV complejo44, que complicaría los intentos de controlar la tensión de la vesícula mediante aspiración de una micropipeta. Este modelo basado en MLV GUV proporcionan una tensión más baja que mejor imita a los regímenes de tensión encontrados las estructuras de la membrana celular conectadas a depósitos de membrana, tales como los pliegues y las invaginaciones de la membrana46. Al mismo tiempo, la técnica de aspiración de la micropipeta puede aplicarse con éxito para controlar la tensión de la membrana en 2.fino sola. Por ejemplo, el trabajo por Graber et al. facilitó detalles sobre la formación de invaginaciones tubulares membrana en 2.fino sola al enlace de los iones de calcio a la membrana en condiciones a granel de tensión variados regímenes40. Finalmente, la comparación del comportamiento de la membrana en la exposición local o a granel a calcio requiere mayor control de la adherencia de la membrana a la superficie, que está fuera del alcance del presente Protocolo.
En Resumen, la técnica propuesta permite sin contacto membrana remodelación y formación del MTPs sobre estimulación localizada con los iones del calcio. Futuras aplicaciones de este centro de método en la traducción de sistemas sintéticos de la vesícula a las membranas biológicas autóctonas, como las ampollas de la célula. El método propuesto puede ser incorporado con otros esquemas de interrogatorio unicelular, como Amperometría de patch-clamp o microelectrodo, o combinado con localizada calefacción estrategias31,47,48. Prueba el efecto de otros iones o moléculas es sencilla y consiste en simplemente sustituir los iones de calcio con las moléculas de interés. Además, se pueden producir vesículas de lípidos sintéticos complejos a través de funcionalización de la membrana con proteínas transmembranales, que puede ampliar nuestra comprensión de la biofísica de dinámica celular remodelación y membrana de la célula asociada con detección de local gradientes químicos. Por último pero no menos importante, la estimulación sin contacto de la membrana de lípidos también puede traducirse a sistemas poliméricos materia blanda, ofreciendo una base para una plataforma de manipulación sin contacto novela.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |