Wir präsentieren eine Technik zur kontaktlosen Mikromanipulation von Vesikeln, mit lokalisierten Kalzium Ionen Steigungen. Mikroinjektion einer Kalzium-Ionen-Lösung, in der Nähe einer riesigen Lipid-Bläschen, wird genutzt, um die Lipidmembran, wodurch die Produktion der Membran röhrenförmige Ausstülpungen umzugestalten.
In einer Vielzahl von grundlegenden Zellprozesse wie Membran Menschenhandel und Apoptose auftreten Zellmembran Form Übergänge gleichzeitig mit lokalen Variationen in Calcium-Ionen-Konzentration. Die wichtigsten molekularen Bestandteile in diese Prozesse eingebunden wurden identifiziert; aber das besondere Zusammenspiel von Kalzium Ionen-Gradienten und die Lipide innerhalb der Zellmembran ist weit weniger bekannt, vor allem aufgrund der Komplexität biologischer Zellen und der Schwierigkeit der Beobachtung Regelungen. Um diese Lücke zu schließen, wird ein synthetischen Ansatz erfolgreich umgesetzt, um die lokalisierte Wirkung von Calcium-Ionen auf Zellmembran Mimik zu offenbaren. Zur Gründung einer Mimik, die Bedingungen innerhalb einer Zelle ähnelt, ist ein severalfold Problem. Erstens ist eine angemessene biomimetische Modell mit entsprechenden Dimensionen und Membran Zusammensetzung erforderlich, um die physikalischen Eigenschaften der Zellen zu erfassen. Zweitens ist eine Mikromanipulation Setup erforderlich, eine kleine Menge von Calcium-Ionen zu einem bestimmten Membran Ort zu liefern. Schließlich ist eine Beobachtung Schema erforderlich, die Reaktion der Lipidmembran auf die externe Stimulation zu erkennen. Dieser Artikel bietet einen detaillierten Biomimetischer Ansatz für das Studium der Kalzium Ionen-Membran Interaktion, wo ein Lipid Vesikel System, bestehend aus einer giant Unilamellar Vesicle (GUV) verbunden mit einer multilamellar Vesikel (MLV), eine lokalisierte Kalzium ausgesetzt ist Farbverlauf gebildet mit einem Mikroinjektion System. Die Dynamik der Ionischen Einfluss auf die Membran mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und aufgenommen im video Frame-Raten. Durch die Membran Stimulation gebogene hoch Membran röhrenförmige Ausstülpungen (MTP) innerhalb der GUV, ausgerichtet von der Membran gebildet. Die beschriebene Vorgehensweise induziert die Umgestaltung der Lipidmembran und MTP-Produktion in einer völlig Kontaktlos und kontrollierte Art und Weise. Dieser Ansatz stellt ein Mittel an die Details des Kalzium Ionen-Membran Interaktionen, bietet neue Wege, um die Mechanismen der Zellmembran Umformung zu studieren.
Die Rolle von Calcium-Ionen in biologischen Prozessen, insbesondere ihre Teilnahme signalisiert, Zellteilung und Membranfusion, steht im Mittelpunkt von vielen mechanistische Studien1. Die intrazellulären zytoplasmatischen Kalzium Ionen-Konzentration ist in der Größenordnung von 100 nM, während das Kalzium in Organellen wie das endoplasmatische Retikulum, sekretorischen Vesikel und Mitochondrien, erreichen bis zu zehn Millimolars in Konzentration. Dies schafft steile Kalzium-Ionen-Konzentration Steigung Größenordnungen über intrazelluläre Membranen2,3,4,5,6,7,8 ,9. Der extrazellulären Kalziumspiegel Ion ist ca. 2 mM und damit, die Variationen der Calcium-Ionen-Konzentration auf die extrazellulären und intrazellulären Ebene auftreten. Darüber hinaus synchronisiert den letzten Studien belegen, dass intrazellulären Calcium-Ion Signalisierung Ereignisse und neuronaler Aktivität kann auftreten, unter den Bedingungen des lokalen Schwankungen der extrazelluläre Kalzium Ionen-Konzentrationen, was die Bedeutung von Intra- und extrazellulären Calcium Ionen-Variationen10.
Mit dem Ziel zu verstehen, das Zusammenspiel von Calcium-Ionen und biologischen Membranen, einen synthetischen Ansatz in dem native Zellmembranen mit Lipid Bilayer Vesikel ersetzt werden ist erfolgreich umgesetzt worden. Verfügbarmachen von Vesikeln zu Kalzium Ionen-Lösungen führt zu Veränderungen in Lipid Kopfgruppen und Kohlenwasserstoff-Kette-Verpackung, erhöhte Membran Spannung und Vesikel Aggregation sowie die Trennung von Lipiden und Membran Phase Übergang11,12 ,13,14,15,16. Die Eigenschaften der Lipidmembranen auf Einwirkung von Kalzium-Ionen wurden untersucht mit solchen experimentelle Techniken wie x-ray, 1H-NMR und spektroskopische oder thermodynamische Studien11,16, 17 , 18. in diesen Studien, die Zusammensetzung der Membran ist oft um native Zellmembranen ähneln abgestimmt und enthält solche physiologische Lipide als Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamine (PE) und Phosphatidylserin (PS). PS ist besonders wichtig in künstliche Vesikel Vorbereitung, denn das ist ein wesentlicher Bestandteil in vielen zellulären Prozessen einschließlich Menschenhandel intrazellulären Membran, Exozytose und Apoptose19,20.
Die Größe der synthetisierten Lipid Vesicles reicht oft von Nanometer bis mehrere Mikrometer. Unter den verschiedenen Vesikel Vorbereitungen, giant Unilamellar Vesikeln (GUVs), die sind mehrere bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser, sind von besonderer Bedeutung aufgrund ihrer relativ großen Größe stark ähnelten die Abmessungen der einzelnen Zellen21 , 22 , 23. die verfügbare Fläche des die GUVs ermöglicht den Effekt von lokalen chemischen Gradienten auf Membran biophysikalische Eigenschaften untersucht werden. Indem man nur ein Teil der Membranoberfläche auf äußere Reize, können die Membran Dynamik genauer untersucht werden. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass lokalisierte Anwendung von chemischen oder pH-Gradienten an der Oberfläche der GUVs führt zur Bildung von röhrenförmigen Vorsprünge, die Masse Exposition24,25nicht eingehalten wurden. Die beobachteten Unterschiede im Verhalten der Membran fordern weitere Methodenentwicklung Single-Vesikel Verhör Regelungen einige Einblicke in die Mechanismen der Zellmembran Umgestaltung.
Aufbauend auf den Methoden der Mikroinjektion und Mikromanipulation aus den frühen 1900er Jahren26,27, im Zusammenhang mit neueren Entwicklungen von Single-Vesikel Manipulation Aktionen in den 2000er Jahren23,28 , dieser Artikel stellt einen Ansatz in die Membran umgestaltet und die Bildung von Membran röhrenförmige Ausstülpungen (MTP) in der GUV-Membran als Reaktion auf lokale Anwendung von Calcium-Ionen entstehen.
Unser Ansatz nutzt eine Vesikel Komplex bestehend aus einer GUV, verbunden mit einem multilamellar Vesikel (MLV) als Modellsystem biomimetische Membran (Abbildung 1A). Der MLV wird als ein Lipid-Reservoir für den Komplex, Lipid-Material für die GUV während der Exposition gegenüber einer Kalzium-Ionen Steigung zu liefern. Diese Verbindung ermöglicht die Anlage zum Ausgleich für die Erhöhung der Membran Spannung während induzierte Umbau und gestalten den Übergang von der GUV-Membran und Lipide für MTP Wachstum. Darüber hinaus ermöglicht der MLV Oberfläche Immobilisierung, weil seine Masse größer ist im Vergleich zu derjenigen der GUV. Die GUV-MLV-komplexe, wenn auf ein festes Substrat immobilisiert haben früher für die Herstellung Nanotube-Vesikel Netzwerke, Studium Polymermembran Interaktion und imitiert die späten Stadien der Exozytose29,30, 31,32,33.
Frühere Protokolle verwendet Sojabohnen polare Lipid-Extrakt (SPE), GUV-MLV komplexe28vorzubereiten. Die SPE besteht aus einer Mischung von Phospholipiden, die umfassen PC (45,7 %), PE (22,1 %), Phosphatidylinositol (PI, 18,4 %), phosphatidic Säure (PA, 6,9 %) und eine Mischung aus anderen Lipiden (6,9 %). In unserem Protokoll hierin ist die SPE-Mischung mit 20 % des 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (Natriumsalz) dotiert (DOPS) um die innere Broschüre der Plasmamembran der Zelle zu imitieren. Zusätzliche 1 % von ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-SCHMIERE) wird verwendet, um Lipid Bilayer zu ermöglichen eine Überwachung der Membran Umbau mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu beflecken. Die GUVs haben symmetrische lipidzusammensetzung über die Bilayer und lokal 5 mM Konzentrationen von Kalzium-Chlorid (CaCl2) ausgesetzt sind. Diese experimentellen Bedingungen, mit einer erhöhten Kalzium-Ionen-Konzentration auch imitieren die Außenmembran Broschüre der Apoptotic Zellen, wo die PS-Moleküle ausgedrückt34sind. Die Bildung der GUV-MLV komplexe erfordert die Verwendung einer modifizierten Rehydration-Dehydratisierung-Methode ursprünglich entwickelt von Criado und Keller35. Die Vesikel Vorbereitung Protokoll beinhaltet die Bildung von einem trockenen Lipidschicht, die dann verwendet wird, um kleine Bläschen in Lösung zu bilden. Diese Lösung ist dann dehydriert und rehydriert um die endgültige GUV-MLV-komplexe bilden. Abbildung 2A -D zeigt die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung eines typischen GUV-MLV-Komplexes.
Nachdem die Vesikel Vorbereitung abgeschlossen ist und die Vesikel Komplex auf dem Glassubstrat immobilisiert ist, wird die Mikroinjektion Technik verwendet, um kleine Mengen von Calcium-Ionen an der äußeren Broschüre GUV durch eine offene Spitze Glas Mikropipette liefern. Der Fluss der Kalzium-Lösung aus der Spitze erzeugt eine lokalisierte Kalzium Ionen-Gradient an der GUV Membranoberfläche, Membran umgestaltet und die MTP-Generation führt. Die MTP orientieren sich weg von der Kalzium-Ionen-Quelle und wachsen innerhalb der GUV. Diese MTP-Formation kann direkt mit Fluoreszenz-Mikroskopie überwacht werden und mit einer Digitalkamera aufgenommen. Abbildung 3 zeigt den Versuchsaufbau zur Herstellung der Membran Umbau verwendet. Die Bildung von MTP (Abb. 2E und Abbildung 4) in diesem Protokoll zeigt ein kontrastierendes Ergebnis Kalzium Ion Belichtung Experimente in loser Schüttung Volumen Bedingungen durchgeführt. Bedingungen der Masse die GUVs Bruch und Membran-Patches, die beobachtet werden können, zur Einhaltung der Glas Oberfläche25bilden.
Weitere Einzelheiten über die Bildung der GUV-MLV-komplexe, sowie das Verfahren der Mikroinjektion von Calcium-Ionen durchführen, werden in diesem Artikel erläutert. Die Protokolle sind weitgehend auf Kalzium-Ionen Mikroinjektion konzentriert; Dieser Ansatz kann jedoch leicht für den Einsatz im Studium der Membran Reaktionen aufgrund der lokalen Exposition gegenüber anderen Ionen oder Proteine geändert werden. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung der Vesikel abgestimmt werden, um die Lipid-Komponente-Rollen bei der Umgestaltung der Membran zu isolieren. Die vorgestellte Protokoll erfordert keiner hoch entwickelten Geräten, die GUV-MLV-komplexe zu produzieren und zeichnet sich durch ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit.
Biomimetische Zellsysteme ermöglichen das Studium der Membran Verhalten nach der Exposition auf äußere Reize wie Ionen, Proteine oder Nanopartikel. GUVs, wird ein solches Modell können auf Veränderungen in der chemischen Umgebung reagieren, durch die Anpassung ihrer Form, die oft mit der Bildung von röhrenförmigen Strukturen und Invaginations24,41,42,43 .
Dieser Artikel bietet einen Ansatz zur MTP berührungslos über Umgestaltung der GUV Oberfläche nach lokalisierte Einspritzung von Calcium-Ionen an der GUV-Oberfläche zu erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung des GUV-MLV-komplexes, die eine Zelle Plasmamembran sowie imitiert, wie eine Mikroinjektion Technik, Kalzium zu generieren beschäftigen Ionen-Gradienten in der Nähe der GUV Form MTP Oberfläche. Die Mehrheit der bisherigen experimentellen Studien, die Kalzium-Ionen-Membran Interaktionen adressiert ausgesetzt Lipid Vesicles, bulk-Kalzium-Ionen-Konzentration14,17. Abhängig von den experimentellen Bedingungen führen solche Massen-Exposition eine andere Membran Antwort mit röhrenförmigen Vorsprünge gebildet25.
Die Bildung der GUV-MLV komplexe ist relativ einfach und erfordert nur standard Laborgeräten, z. B. einen drehverdampfer Ultraschallbad und Vakuum Exsikkator. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte zu prüfen, während der Vesikel-Vorbereitung. Es ist wichtig, damit die Austrocknung der Vesikel ist abgeschlossen (während Schritt 2.3 des Protokolls) und ein trockene Runde Lipid-Film, enthält nur eine kleine Menge von Salzkristallen wird auf der Oberfläche des Deckglases Glas gebildet. Während des Experiments sorgfältige Handhabung der Vesikel-Lösung mit frischen Lipid-Stammlösung in Chloroform sowie frische HEPES-Puffer ist entscheidend für erfolgreiche Vorbereitung der GUV-MLV komplexe. Darüber hinaus ist die sichere Befestigung des GUV-MLV Komplexes auf der Glasoberfläche Deckglas entscheidend für Mikromanipulation und Mikroinjektion. Um ausreichende Haftung der GUV-MLV bestätigen Komplex, mikropipette (ohne Injektion Strömung) lässt sich sanft gegen die GUV-Oberfläche drücken. Eine fest haftende Vesikel wird nicht entlang der Oberfläche bei direktem Körperkontakt gleiten. Da die Experimente in einem offenen Puffer Tropfen durchgeführt werden, die mehrere Stunden lang verhört werden kann, muss Verdunstung berücksichtigt werden. Verdunstung aus den Puffer Tropfen ändert die osmotischen Verhältnisse beeinflussen und die Vesikel zu destabilisieren könnte. Um die osmotischen Verhältnisse wiederherzustellen, zurückgegeben periodische Zugabe von reinem Wasser der Probe zur Wiederherstellung des ursprünglichen Volumens an Homöostase.
Wenn Sie die Lipid-Membran-Zusammensetzung zu ändern, ist es entscheidend, dass die Vesikel in Form einer GUV-MLV-Anlage produziert werden, weil die MLV das Lipid-Material auf die GUV übertragen ermöglicht, während die Membran Umgestaltung. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bestandteile der SPE-Mischung mit reinen Lipiden ersetzen oder Zugabe von 5-30 % des Cholesterins, auch für GUV-MLV Komplexbildung28,44 ermöglicht. Der Großteil der vorbereiteten GUVs sind Unilamellar45.
Darüber hinaus hängt beim Testen von anderen zweiwertigen kationen wie Magnesium-Ionen, die Bildung der MTP das Vorhandensein von negativ geladenen DOPS in der Lipid-Mischung. Ohne DOPS bilden die MTP nicht in den Vesikeln, die in diesem Protokoll beschrieben. Monovalente kationen, wie Kalium und Natrium, auch führen nicht bei der Bildung von MTP, sogar in DOPS-haltige Vesikel25.
Neben der kritischen Schritte im Hinblick auf die Erstellung und Manipulation von der GUVs gibt es mehrere wichtige Faktoren zu berücksichtigen bei der Mikroinjektion. Die erfolgreiche Mikroinjektion von Calcium-Ionen stützt sich stark auf einwandfrei Glas Mikropipetten, die am Tag des Experiments zubereitet werden. Es gibt mehrere Faktoren, die die Mikropipette zu Fehlfunktionen führen können. Eine häufige Ursache ist eine verstopfte Tipp-Öffnung. Kleinen Lipid Partikel, die Nebenprodukte der Vesikel-Vorbereitung sind, sind in der Lösung verteilt und zur Einhaltung der Mikropipette Spitze, dadurch erzeugt eine Verstopfung neigen. Die PIPETTENSPITZE Reinigung erfolgt am besten durch Anheben der Vesikel-Lösung und stellen Sie es wieder in der Nähe der GUV-Oberfläche. Die Nutzung der Blow-Out-Funktion der Mikroinjektion Pumpe muss vermieden werden, da es zu massiven Einspritzung von Calcium-Ionen in die Masse Lösung führt. Darüber hinaus zu verhindern, dass kleine Luftblasen eingeschlossen innerhalb der Mikropipette richtige Mikroinjektion, in dem Fall die Mikropipette durch einen neuen ersetzt werden sollte. Tipp Bruch kann deutlich minimiert werden, indem der Versuchsaufbau auf einer Schwingungsdämpfung Tabelle Tipp Schwingungen zu minimieren.
Darüber hinaus muss sorgfältig getroffen werden, bei der Wahl einer Beobachtung Schema Immunofluoreszenz zu minimieren, während die besten Zeitaufgelöste Bilder zu erhalten. Weitfeld-laserinduzierter Fluoreszenz-Mikroskopie wurde in dieses Protokoll eingesetzt, weil es eine relativ hohe Bild-Erfassungsrate auf einer objektiven begrenzt Sonde Tiefe ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Nutzung der invertierten Mikroskopie für gleichzeitige Mikroinjektion und Beobachtung der Lipid-Vesikeln und MTP.
Eine der wichtigsten Einschränkungen der vorgestellten Methode ist das Erfordernis der umfangreichen Handarbeit und ausreichende Kenntnisse der Mikromanipulation. Da die komplexe durch einen spontanen Schwellung gebildet werden, kann die Größe der GUVs und MLV gesteuert werden. Darüber hinaus erlaubt dieses Protokoll nicht um die Kontrolle über die Membran-Spannung der vorbereiteten GUV-MLV-komplexe, die möglicherweise notwendig, zusätzliche Details in Bezug auf die Membran Umbau zu sammeln. Die GUVs sind die MLV mit dem letzteren liefernden Lipid-Material für das erhebliche Wachstum des MTP in einem Ausmaß, die wäre unmöglich zu erreichen, unter Verwendung ausschließlich die Membran von der GUVs verbunden. Der MLV tragen ebenfalls zur Senkung der seitlichen Oberflächenspannung Abweichungen innerhalb der GUV-MLV komplexe44, die die Versuche, die Spannung des vesikels mit Mikropipette Aspiration Steuern erschweren würde. Diese GUV-MLV-basiertes Modell liefert eine niedrigere Spannung, die besser die Spannung Regime in zellulären membranstrukturen verbunden mit Membran Stauseen, wie z. B. Membran Falten und Invaginations46gefunden imitiert. Zur gleichen Zeit kann die Mikropipette streben Technik erfolgreich angewendet werden, um Membran Spannung in einzelnen GUVs kontrollieren. Zum Beispiel Angaben die Arbeit von Graber Et Al. auf die Bildung der Membran röhrenförmige Invaginations im einzelnen GUVs bei der Bindung von Calcium-Ionen an der Membran zu Bulk-Konditionen von vielfältigen Spannungen Regime40. Schließlich erfordert der Vergleich des Verhaltens sowohl auf lokaler als auch auf Bulk Exposition gegenüber Kalzium Membran verbesserte Kontrolle über die Membran Haftung auf der Oberfläche, die über den Rahmen dieses Protokolls ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, können die vorgeschlagene Technik für kontaktlose Membran Umbau und Bildung von MTP auf lokalisierte Stimulation mit Calcium-Ionen. Zukünftige Anwendungen dieser Methode-Center auf die Übersetzung von synthetischen Vesikel-Systeme zur heimischen biologischen Membranen, wie Zelle Blebs. Die vorgeschlagene Methode kann anderen einzelligen Verhör-Programme, wie z. B. Patch-Clamp oder Mikroelektrode strommesstechnik eingearbeitet oder in Kombination mit Heizung Strategien31,47,48lokalisiert. Testen die Wirkung anderer Ionen oder Moleküle ist unkompliziert und geht einfach die Kalzium-Ionen durch die Moleküle des Interesses zu ersetzen. Darüber hinaus können komplexe synthetische Lipid Vesicles durch Membran Funktionalisierung mit transmembranen Proteine produziert werden, die unser Verständnis über die Biophysik Zelldynamik Umformen und Zellmembran verbunden mit der lokalen sensing erweitern kann chemischen Gradienten. Nicht zuletzt, kontaktlose Stimulation der Lipidmembran zu Polymeren weicher Materie Systemen, bieten eine Basis für eine neuartige kontaktlose Manipulation Plattform übersetzt werden kann.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |