Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.
Temel hücre süreçler, membran kaçakçılığı ve apoptosis, gibi çok çeşitli hücre zarının şekli geçişler kalsiyum iyonu konsantrasyonu yerel varyasyonlar ile aynı anda ortaya. Ana moleküler bileşenleri Bu süreçlerle ilgili tespit edilmiştir; Ancak, belirli Interplay kalsiyum iyon gradyanlar ve hücre zarı içinde lipidler arasında çok daha az, özellikle biyolojik hücreleri karmaşık yapısı nedeniyle bilinmektedir ve gözlem düzenleri, zor. Sentetik bir yaklaşım bu boşluğu için başarıyla hücre zarı taklit eder lokalize kalsiyum iyonlarının etkisi ortaya çıkarmak için uygulanır. Hücre içindeki koşullar benzemeye bir taklit kurma severalfold bir sorundur. İlk olarak, uygun boyutları ve membran kompozisyon bir yeterli biomimetic modeliyle hücrelerin fiziksel özelliklerini yakalamak için gereklidir. İkinci olarak, embriyolardan Kur az miktarda kalsiyum iyonları belirli membran konuma teslim için gereklidir. Son olarak, bir gözlem düzeni algılamak ve lipid membran yanıt dış uyarılması için kayıt için gereklidir. Bu makale, nerede multilamellar bir vezikül (MLV), bağlı bir dev unilamellar vezikül (şef) oluşan bir lipid vezikül sistemi için yerelleştirilmiş bir kalsiyum maruz kalsiyum iyon-membran etkileşim çalışmak için detaylı biomimetic yaklaşım sunar degrade mikroenjeksiyon sistemi kullanılarak oluşturulmuş. Membran iyonik etkisi dinamikleri floresans mikroskobu kullanılarak gözlenen ve video kare hızlarında kaydedildi. Membran uyarılması sonucu olarak son derece uzak membran odaklı Şef içinde oluşturduğu membran borulu çıkıntılar (MTPs) kavisli. Açıklanan yaklaşım tamamen temassız ve kontrollü bir şekilde lipid membran ve MTP üretim remodeling neden olmaktadır. Bu yaklaşım hücre zarının yeniden şekillendirilmesi mekanizmaları incelemek için yeni yollar sağlayan kalsiyum iyon-membran etkileşimlerin Ayrıntılar adres için bir araç sunar.
Kalsiyum iyonları Biyolojik süreçler, sinyal, hücre bölünmesi ve membran fusion, özellikle onların katılımı içinde odak birçok mekanik çalışmalar1rolüdür. Hücre içi sitoplazmik kalsiyum iyonu konsantrasyonu sırasına 100dür nM, endoplazmik retikulum, salgı veziküller ve mitokondri, gibi organellerin kalsiyum süre kadar millimolars konsantrasyon onlarca düzeyleri ulaşmak. Bu hücre içi membranlar2,3,4,5,6,7arasında,8 dik kalsiyum iyon konsantrasyonu degrade büyüklük oluşturur ,9. Ekstrasellüler kalsiyum iyon düzeyi 2 mM civarında ve bu nedenle, her iki hücre dışı ve hücre içi düzeyde kalsiyum iyonu konsantrasyonu varyasyonları oluşur. Ayrıca, son çalışmalar bu hücre içi kalsiyum iyon olaylar sinyalizasyon kanıt ve nöronal aktivite ekstraselüler kalsiyum iyon konsantrasyonlarının, önemini gösteren yerel dalgalanmalar koşullar altında ortaya çıkabilir senkronize Intra – ve ekstraselüler kalsiyum iyon değişimleri10.
Kalsiyum iyonları ve biyolojik membranlar, yerel hücre zarlarında lipid bilayer veziküller ile yerine sentetik bir yaklaşım arasındaki etkileşimi anlamak amaçlayan başarıyla uygulamaya konmuştur. Veziküller kalsiyum iyon çözümlere açığa lipid kafa grupları ve hidrokarbon zinciri ambalaj, artan membran gerginlik ve vezikül toplama yanı sıra lipidler ve membran faz geçiş11,12 ayrılığı değişikliklere yol açar ,13,14,15,16. Lipid membranlar maruz kalsiyum iyonları için üzerine özelliklerini x-ışını, 1H-NMR ve spektroskopik veya termodinamik çalışmalar11,16, bu tür Deneysel teknikler kullanarak araştırdık 17 , 18. bu çalışmalarda membran kompozisyon kez yerel hücre zarlarında benzemek için ayarlanmıştır ve fizyolojik böyle lipidler phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) ve Fosfatidilserin (PS) içerir. PS hücre içi membran kaçakçılığı, ekzositozu ve Apoptozis19,20de dahil olmak üzere birçok hücresel süreçlerinde önemli bir bileşeni olduğundan yapay vezikül hazırlanmasında özellikle önemlidir.
Sentezlenmiş lipid veziküller boyutunu kez nanometre birkaç mikrometre arasında değişmektedir. Farklı vezikül hazırlıkları arasında dev unilamellar veziküller (GUVs), hangi are birkaç mikrometre çapında onlarca için bireysel boyutları hücreleri21 yakından benzeyen onların nispeten büyük boyutları nedeniyle özellikle önem vardır , 22 , 23. GUVs mevcut yüzey alanı yerel kimyasal degradeler etkisi incelenecektir için membran biyofiziksel özellikleri sağlar. Membran yüzey dış uyaranlara karşı yalnızca bir bölümünü açarak, membran dynamics daha yakından soruşturma. Örneğin, kimyasal ya da pH degradeler yerelleştirilmiş uygulama GUVs yüzeyine toplu poz24,25, gözlenen değil borulu çıkıntılar oluşumuna yol açar gösterilmiştir. Hücre zarının remodeling mekanizmaları biraz anlayışlar kazanmak için tek veziküllü sorgulama düzenleri yöntem geliştirilmesi için gözlenen membran davranış farklılıkları arayın.
Embriyolardan erken 1900’lerde26,ile27, 2000’lerde23,28 tek veziküllü manipülasyon düzenlerinden daha yeni gelişmeler ile bağlantılı olarak ve mikroenjeksiyon yöntemleri üzerine bina , bu makalede hangi membran yenileme ve membran borulu çıkıntılar (MTPs) Şef membran oluşumu oluşturulur kalsiyum iyonlarının yerel uygulama yanıt olarak bir yaklaşım sunuyor.
Yaklaşımımız bir biomimetic membran modeli sistemi (Şekil 1A) multilamellar bir vezikül (MLV) bağlı bir şef oluşan karmaşık bir vezikül kullanır. MLV olarak lipid depo kompleks kalsiyum iyon degrade maruz sırasında Şef lipid malzeme sağlamak için gereklidir. Bu bağlantı indüklenen tadilat sırasında membran gerginlik artışı telafi etmek ve Şef membran geçiş şekil ve lipidler MTP büyüme için sağlamak için karmaşık tanır. Kütlesi büyük olduğu için Ayrıca, yüzey immobilizasyon MLV kolaylaştırır Şef e kıyasla. Ne zaman bir katı substrat immobilize Şef-MLV kompleksleri daha önce nanotüp veziküllü ağlar üreten, polimer membran etkileşim eğitim ve ekzositozu29,30geç aşamalarında taklit için kullanılmıştır, 31,32,33.
Önceki iletişim kuralları soya polar lipit özü (SPE) Şef-MLV kompleksleri28hazırlamak için kullanılan. SPE phosphatidic asit (PA, % 6,9) ve diğer lipidler (% 6,9) karışımı içeren PC (%45.7), PE (%22,1), phosphatidylinositol (PI, %18,4), fosfolipitler karışımından oluşur. Burada bizim protokolünde, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodyum tuzu) % 20’si ile SPE karışımı katkılı hücre plazma zarı iç broşürü taklit etmek için (DOPS). Ek bir %1 sınav 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) membran floresans mikroskobu kullanılarak remodeling izleme özelliğini etkinleştirme lipid bilayer leke için kullanılır. GUVs simetrik lipid kompozisyon var bilayer arasında ve yerel olarak kalsiyum klorür (CaCl2) 5 mM konsantrasyonları maruz kalır. Bu deneysel koşullar, bir yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonu ile Ayrıca PS molekülleri ifade34nerede apoptotik hücrelerin dış membran broşür taklit. Şef-MLV kompleksleri oluşumu başlangıçta Criado ve Keller35tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş rehidratasyon su kaybı yöntemi kullanılmasını gerektirir. Vezikül hazırlık Protokolü sonra küçük veziküller içinde çözüm oluşturmak için kullanılan bir kuru lipid tabakanın oluşumu içerir. Bu çözüm sonra susuz ve son Şef-MLV konut projeleri oluşturmak üzere rehydrated. Şekil 2A -D tipik bir şef-MLV kompleks hazırlanması için ana adımları göstermektedir.
Vezikül hazırlık tamamlanmış ve karmaşık vezikül cam alt katman üzerinde immobilize sonra mikroenjeksiyon tekniği ile bir açık uçlu cam micropipette Şef e dış broşürü az miktarda kalsiyum iyonları sunmak için kullanılır. Kalsiyum çözüm ucu dışarı akışını membran yenileme ve MTPs nesil için önde gelen Şef membran yüzeyinde lokalize kalsiyum iyon degrade oluşturur. MTPs kalsiyum İyon kaynağı uzak odaklı ve Şef içinde büyür. Bu MTP oluşumu doğrudan floresans mikroskobu aracılığıyla izlenebilir ve bir dijital kamera ile kaydedildi. Şekil 3 membran remodeling üretmek için kullanılan deneysel kurulumu gösterir. Bu iletişim kuralı (Şekil 2E ve Şekil 4) MTPs oluşumu toplu güç koşullarda gerçekleştirilen kalsiyum iyon pozlama deneyler için zıt bir sonuç gösterir. Toplu koşullarda GUVs rüptürü ve form için cam yüzey25uymaları gözlenen membran yamalar.
Daha Şef-MLV kompleksleri yanı sıra kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için yordam oluşumu ile ilgili ayrıntılar, bu makalesinde açıklanmıştır. İletişim kuralları büyük ölçüde kalsiyum iyon mikroenjeksiyon üzerinde duruldu; Ancak, bu yaklaşım yerel veya maruz kalma diğer iyonlar proteinler nedeniyle membran yanıt eğitim kullanmak için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, veziküller bileşimi membran yenileme sürecinde lipid bileşeni rolleri yalıtmak için ayarlanabilir. Sunulan Protokolü Şef-MLV kompleksleri üretmek için herhangi bir gelişmiş donanım gerektirmez ve tekrarlanabilirlik yüksek derecesi ile karakterizedir.
BioMimetic hücre sistemleri membran davranış iyonları, proteinler veya nano tanecikleri gibi dış uyaranlara karşı maruz üzerine bir çalışma için izin verir. Böyle bir model olmak gUVs, kimyasal ortamda değişiklikler sık sık tübüler yapılar ve invaginations24,41,42,43 oluşumu içerir onların şekli ayarlayarak yanıt verebilir .
Bu makale, MTPs Şef yüzey üzerine yerelleştirilmiş enjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının remodeling ile temassız bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunar. Protokol ne kadar kalsiyum oluşturmak için bir mikroenjeksiyon tekniği kullanırım için iyon degradeler Şef e yakın forma MTPs yüzey de bir hücre plazma zarı taklit eden Şef-MLV kompleks hazırlanması açıklar. Kalsiyum iyon-membran etkileşimleri ele önceki deneysel çalışmalarda çoğunluğu kalsiyum iyon konsantrasyonu14,17toplu olarak lipid veziküller maruz. Deneysel koşullarına bağlı olarak, bu tür toplu poz yok borulu çıkıntılar oluşan25farklı membran yanıtta neden olabilir.
Şef-MLV kompleksleri oluşumu oldukça basittir ve sadece standart Laboratuar donanımları, rotary evaporatör, ultrasonik banyo ve vakum desiccator gibi gerektirir. Yine de, vezikül hazırlık sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli kritik adımlar vardır. (Veziküller susuzluktan adım iletişim kuralı sırasında 2.3) tamamlandıktan ve az miktarda tuz kristallerinin içeren bir Kuru dairesel lipid film cam kapak kayma yüzeyi üzerinde oluşturulur emin olmak önemlidir. Deneme sırasında dikkatli vezikül çözümü, işleme kloroform yanı sıra taze HEPES tampon, taze lipid hisse senedi çözüm kullanmaktır Şef-MLV kompleksleri başarılı hazırlanması için gerekli. Ayrıca, güvenli bağlanma cam kapak kayma yüzeyi Şef-MLV kompleks embriyolardan ve mikroenjeksiyon için çok önemlidir. Şef MLV yeterli yapışma onaylamak için karmaşık, micropipette (enjeksiyon akışı) olmadan yavaşça Şef yüzeyine karşı itmek için kullanılabilir. Sıkıca yapıştırılan bir vezikül üzerine doğrudan fiziksel temas yüzeyi boyunca kaydırın değil. Çünkü deneyler için birkaç saat sorguya, bir açık arabellek damlacık içinde gerçekleştirilir buharlaşma dikkate alınması gerekir. Buharlaşma arabellek damlacık gelen etkiler ve veziküller istikrarsızlaştırmak ozmotik koşullar değişecek. Ozmotik koşullar geri yüklemek için sistem periyodik özgün birimi geri yüklemek için örnek için saf su ilavesi homeostazı için döndürür.
Lipid membran kompozisyon değiştirirken MLV membran yeniden şekillendirme sırasında Şef’e lipid malzeme aktarmak için izin verdiğinden veziküller Şef-MLV kompleksi şeklinde üretilen önemlidir. Önceki çalışmalar ile saf lipidler SPE karışımı bileşenleri değiştirme veya kolesterol, % 5-30’u eklemek de Şef-MLV karmaşık oluşumu28,44için sağlar göstermiştir. Hazırlanan GUVs unilamellar45çoğu.
Ayrıca, magnezyum iyonları gibi diğer divalent katyonlar sınarken MTPs oluşumu ağır lipid karışımı olumsuz ücret DOPS varlığını bağlıdır. DOPS, bu protokol için açıklanan veziküller içinde MTPs oluşturmaz. Ayrıca, potasyum ve sodyum, gibi monovalent katyon oluşumunda MTPs, hatta veziküller25DOPS içeren, neden değil.
Hazırlık ve GUVs manipülasyon ile ilgili kritik adımlarına ek olarak, mikroenjeksiyon işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli faktörler önemli. Kalsiyum iyonlarının başarılı mikroenjeksiyon ağır düzgün çalışıp dayanmaktadır cam deneme günü hazır mısın Mikropipetler. Çeşitli faktörler micropipette çalışmasına neden olabilir. Ortak bir akıl tıkanmış ipucu açıyor. Yan vezikül hazırlanması, çözüm içinde dağınık ve böylece bir tıkanma üreten micropipette ucuna kadar uygun eğilimi küçük lipid parçacıkları. Pipet Ucu temizleme en iyi vezikül eriyik–dan yukarı kaldırarak ve Şef yüzeye yakın yerleştirerek yapılır. Çünkü toplu çözüm içine kalsiyum iyonlarının büyük enjeksiyon içinde sonuçlar mikroenjeksiyon pompa blow-out işlevinin kullanımını kaçınılmalıdır. Ayrıca, küçük hava kabarcıkları micropipette içinde entrapped uygun mikroenjeksiyon, dava micropipette yenisi ile değiştirilmelidir önlemek. İpucu kırılması önemli ölçüde deneysel Kur ipucu salınımlarını en aza indirmek için bir titreşim nemlendirme masaya yerleştirerek en aza indirilebilir.
Ayrıca, bakım photobleaching zaman karar vermek en iyi görüntüleri elde ederken en aza indirmek için bir gözlem düzeni seçerken alınması gerekiyor. Çünkü bir objektif sınırlı sonda derinlikte bir nispeten yüksek görüntü edinme oranı sağlar geniş alanlı lazer kaynaklı floresans mikroskobu bu protokol için kullanılmıştır. Ayrıca, ters mikroskobu kullanımını eşzamanlı mikroenjeksiyon ve lipid veziküller ve MTPs gözlem olanağı sağlar.
Bir sunulan yönteminin ana sınırlamaları kapsamlı el ile çalışmaları ve yeterli embriyolardan becerileri gereksinimdir. Kompleksleri bir spontan şişme sürecinde oluşur çünkü, GUVs ve MLVs boyutunu kontrol edilemez. Ayrıca, bu iletişim kuralını membran yenileme ile ilgili ek ayrıntıları toplamak gerekli olabilir hazır şef-MLV kompleksleri membran gerginlik kontrolü için izin vermez. GUVs MLVs sadece GUVs kullanılabilir membran kullanarak elde etmek imkansız bir ölçüde MTPs önemli büyüme için ikinci sağlama lipid malzeme ile bağlanır. MLVs de hangi vezikül gerilimi micropipette aspirasyon kullanarak denetlemek için girişimleri karmaşık Şef-MLV karmaşık44içinde herhangi bir yan yüzey gerilimi varyasyonları düşürülmesi için katkıda bulunur. Bu Şef-MLV tabanlı model daha iyi membran kıvrımlar ve invaginations46gibi membran su depoları bağlı hücresel membran yapılar bulunan gerginlik rejimler taklit eden bir alt gerginlik sağlar. Aynı zamanda, micropipette Aspirasyon tekniği başarıyla tek GUVs membran gerginlik denetlemek için uygulanabilir. Örneğin, Graber vd. eseri ayrıntıları membran borulu invaginations bağlama üzerine tek GUVs içinde kalsiyum iyonlarının oluşumu için toplu koşulları, membran çeşitli gerilim rejimler40sağlanan. Son olarak, hem yerel hem de toplu pozda kalsiyum için membran davranışının karşılaştırma bu protokolü kapsamý dýþýndadýr yüzeye membran yapıştırılması Gelişmiş denetimi gerektirir.
Özetlemek gerekirse, temassız membran yenileme ve kalsiyum iyonları ile yerelleştirilmiş stimülasyon üzerine MTPs oluşumu için önerilen tekniği sağlar. Sentetik vezikül sistemlerden çeviri için hücre blebs gibi yerel biyolojik membranlar üzerinde bu yöntemi merkezinin gelecekteki uygulamalar. Önerilen yöntem Birleşmiş amperometry, yama-kelepçe veya elektrot gibi diğer tek hücreli sorgulama düzenleri ile veya ile birlikte lokalize stratejileri31,47,48Isıtma. Diğer iyonlar veya moleküller etkisini test basittir ve sadece faiz molekülleri ile kalsiyum iyonları yerine içerir. Ayrıca, karmaşık sentetik lipid veziküller ile yerel algılama ile ilişkili hücre yeniden şekillendirilmesi ve hücre zarının dinamiği Biyofizik anlayışımızı genişleyebilir transmembran proteinler membran functionalization yoluyla üretilen kimyasal degradeler. Son olarak, lipid membran temassız uyarılması da polimer yumuşak madde sistemleri, bir roman temassız manipülasyon platform için bir temel sunan için tercüme edilebilir.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |