Summary
Här presenterar vi en ny metod för att identifiera växten virus med dubbel-strand DNA genomen. Vi använder standardiserade metoder att extrahera DNA och RNA från infekterade blad och genomföra nästa generations sekvensering. Bioinformatiska verktyg montera sekvenser i contigs, identifiera contigs som representerar virus arvsmassa och tilldela genomen taxonomiska grupper.
Abstract
Detta metagenome tillvägagångssätt används för att identifiera bildregistreringar och växt virus med cirkulära DNA-genomet. Ofta växt DNA virus som förekommer i låga titrar i deras mottagande eller inte ympas mekaniskt till en annan värd är svåra att propagera för att uppnå en större titer av smittsamt material. Infekterade bladen mals i en mild buffert med optimalt pH och Joniska sammansättning rekommenderas för rening av de flesta bacilliform Para retrovirus. Urea används för att bryta upp organ i inkludering som fälla virioner och att upplösa cellulära komponenter. Differentiell centrifugering ger ytterligare separation av virioner från växten föroreningar. Sedan avlägsnar proteinas K behandling förhoppningsvis. Sedan är den virala DNA koncentrerad och används för nästa generations sekvensering (NGS). NGS data används för att montera contigs som lämnas till NCBI-BLASTn att identifiera en delmängd av virus sekvenser i genererade datamängden. I en parallell rörledning är RNA isolerade från infekterade blad med en standard kolumnbaserade RNA extraktion metod. Sedan utförs Ribosomen utarmning för att berika för en delmängd av mRNA och virus avskrifter. Monterade sekvenser härrör från RNA sekvensering (RNA-seq) överlämnades till NCBI-BLASTn att identifiera en delmängd av virus sekvenser i den här datauppsättningen. I vår studie har identifierat vi två relaterade fullängds badnavirus genomen i två datamängder. Denna metod är att föredra en annan gemensam strategi som extraherar den sammanlagda befolkningen av små RNA-sekvenser för att rekonstituera växt virus genomsekvenser. Denna sistnämnda gjorts pipeline återvinner virus relaterade nummerserier som är retro-transkribera element infogas i växten genomet. Detta är kopplat till biokemiska eller molekylära analyser att ytterligare urskilja de aktivt smittämnen. Den strategi som dokumenteras i denna studie, återvinner sekvenser representant replikera virus som sannolikt visar aktiv virusinfektion.
Introduction
Framväxande växtsjukdomar kör forskare att utveckla nya verktyg för att identifiera den rätta kausala medel. Första rapporterna om nya eller återkommande virussjukdomar baseras på vanligt förekommande symtom såsom mosaik och missbildningar av leaf, ven clearing, dvärgväxt, vissnande, lesioner, nekros, eller andra symtom. Standarden för rapportering ett nytt virus som kausala agenten för en sjukdom är att skilja det från andra kontaminerande patogener, sprida det i lämplig värd och återskapa sjukdomen genom ympning till friska plantor av den ursprungliga värd-arten. Begränsningen i denna strategi är att många släkten växt virus är beroende av en insekt eller andra vektorer för överföring till en lämplig värd eller tillbaka till den ursprungliga värdart. I detta fall sökandet efter lämplig vektorn kan förlängas, det kan finnas svårigheter att fastställa laboratorium kolonier av vektorn och ytterligare ansträngningar är nödvändiga för att utarbeta ett protokoll för experimentell överföring. Om förutsättningarna för framgångsrik laboratoriestudier överföring inte kan uppnås, då underskrider arbetet standarden för rapportering en ny virus-sjukdom. För virus som förekommer i deras naturliga värdar på mycket låga titrar, måste forskarna identifiera alternativa värdar för förökning för att upprätthålla tillräckliga smittsamma lager för att bedriva forskning. Detta kan också vara ett hinder för växande lager kulturer1för virus arter som infekterar endast några växter.
Under senare år har anställer forskare oftare hög genomströmning NGS och gjorts metoder för att upptäcka virus sekvenser som finns i miljön, som kan finnas orelaterade till en känd sjukdom, men kan tilldelas taxonomiska arter och släkten 2 , 3 , 4. sådana strategier för upptäckten och kategorisering av genetiskt material i en distinkt miljö ger ett sätt att beskriva virus mångfald i naturen eller deras närvaro i vissa ekosystem men inte nödvändigtvis bekräftar att en ram för att fastställa kausala agenter för en uppenbar sjukdom.
Släktet Badnavirus tillhör familjen Caulimoviridae av pararetroviruses. Dessa virus är bacilliform i form med cirkulär double strand DNA genomen hos cirka 7 till 9 kb. Alla pararetroviruses replikera genom intermediär RNA. Pararetroviruses finns som episomes och replikera oberoende av växten kromosomala DNA5,6. Fältstudier av virus populationer indikerar att dessa virus populationer är genetiskt komplexa. Dessutom har uppgifter som erhållits inom ett spektrum av anläggningen genom hög genomströmning sekvensering upptäckt många exempel på badnavirus genomet fragment infogas av oäkta integration händelser i anläggningen genomen. Dessa endogena badnavirus sekvenser är inte nödvändigtvis förknippade med infektion7,8,9,10,11. Därefter, användning av NGS att identifiera nya badnaviruses som kausala agenten av sjukdom kompliceras av delpopulationer mångfalden av episomal genom samt förekomsten av endogena sekvenser12,13.
Medan det finns inte en optimal pipeline för upptäckten av Roman pararetrovirus genomen, finns det två vanliga metoder att identifiera dessa virus som causal agenter för sjukdom. En metod är att berika för små RNA-sekvenser från infekterade blad och sedan montera dessa sekvenser för att rekonstruera den virus genome(s)14,15,16,17. En annan metod är rullande cirkel förstärkning (RCA) för att förstärka cirkulär DNA-virus genomen18. Framgången för RCA beror på åldern av bladet och virus titern i valda vävnaden. RCA-produkterna utsätts för begränsning matsmältningen och klonade in plasmider för direkt sekvensering19,20,21.
Canna gul mottle virus (CaYMV) är en badnavirus och beskrivs som etiologiska orsaken gul mottle sjukdomen i canna, även om endast ett 565 bp fragment av genomet har tidigare isolerats från infekterade cannas22. En internationell studie identifierat CaYMV i Alpinia purpurata (blommande ingefära; CaYMV-Ap)23. Målet med denna studie var att återfå fullständig badnavirus genomet sekvenser från infekterade canna liljorna. Vi beskriver ett protokoll för rening av virus från växten föroreningar, och sedan isolera virus-DNA från denna beredning och förbereda ett DNA-bibliotek för användning i NGS. Denna strategi eliminerar behovet av mellanliggande molekylär förstärkning steg. Vi isolerar också mRNA från infekterade plantor för RNA-följande punkter NGS, vilket inkluderar RNA-seq utfördes med tillredningen nukleinsyra. Monterade contigs konstaterades för att relatera till det Badnavirus taxonet i både datamängder med nationellt centrum för bioteknik och Information (NCBI) grundläggande lokal justering sökverktyg för nukleinsyror (BLASTn). Vi identifierat genomen hos två badnavirus arter24.
Protocol
1. allmänna Virus rening genom Differential centrifugering använda Standard metoden som Covey o.a. 25
- Först skär 80-100 g blad från sjuka växter och slipa i en waring mixer vid 4 ° C med 200 mL slipning buffert (0,5 M NaH2PO4, 0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2). och 0,5% (w/v) Na2SO3). Använd laboratorierock och skyddshandskar för alla steg i proceduren.
- Överför sedan Homogenatet (300 mL) till en 1,0 L bägare. Lägga till 18 g urea och 25 mL 10% Nonjonaktivt rengöringsmedel (t-okt-C6H4-(OCH2CH2)9OH) Homogenatet inuti en kemisk huva.
Obs: För detta steg är det bäst att bära skyddsglasögon och en enkel andningsmask för personligt skydd. - Rör om med en magnetisk omrörare kort i huven och Täck bägaren med folien. Sedan överföra folie omfattas bägaren till ett kallt rum och rör med en magnetisk omrörare över natten vid 4 ° C.
- Överföra Homogenatet för att Centrifugera rotor flaskor (250 mL behållare) och Centrifugera i en fast vinkel rotor vid 4000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. I kemiska dragskåp, återvinna supernatanten och filtrera genom 4 lager av cheesecloth.
- Dela upp Homogenatet bland 38,5 mL polypropylen centrifugrör och Centrifugera i 2,5 h vid 40 000 x g vid 4 ° C. Typiskt, kontrollera förekomsten av en grön pellets på botten av röret och en vit pellet längs längden av röret. Häll av supernatanten och behålla båda pelletar; Placera prover på is.
Obs: Den gröna pelleten innehåller kloroplaster, stärkelse och andra organeller. - Arbetar i en kemisk huva, Använd en gummi polis för att separera pellets. Återsuspendera vit pelleten i varje rotor flaska i 1 mL av ddH2O under loppet av 1-2 h bibehållen upphängningarna övernattning på 4 ° C så att material till helt lös i lösning. Centrifugera fjädringen på 6 000 x g och vid 4 ° C i ca 10 min att ta bort kvarvarande skräp.
- Centrifugera i koncentrerad suspension vid 136.000 x g under 2 timmar vid 4 ° C till pellet virioner. Återsuspendera pellets i 1 mL buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2).
Obs: Ett valfritt steg är att behandla virioner med DNAS jag (10 µg/mL) under 10 minuter vid 37 ° C att ta bort icke-encapsidated DNA, dvs kontaminerande kloroplast och mitokondrie-DNA. Sedan, inaktivera DNAS jag genom att lägga till EDTA 1 mM. - Störa virioner med 40 µL av 2 µg/µL proteinas K vid 37 ° C i 15 min.
- Fungerar inuti en kemisk huva att återställa virion DNA genom organiska extraktion. Bära en ansiktsmask, handskar och en laboratorierock under utvinning för skydd mot potentiella akuta hälsoeffekter. Tillsätt 1 volymdel fenol-kloroform-isopentanol (49:50:1) och skaka hand i 20 s. Centrifugera vid rumstemperatur för 5 min vid 16.000 x g. ta bort övre vattenfasen och överföring till en ny tub. Upprepa denna extraktion två eller fler gånger. Kassera den organiska fasen genom att placera det i en avfall glasflaska för institutionella kemiska omhändertagande26.
- Koncentrera sig DNA använder etanol nederbörd. Använda 0,3 M slutkoncentration natriumacetat (pH 5.2) och 2,5 volymer av 95% etanol. Placera prover vid-20 ° C i 30-60 min och centrifugera vid 13 000 x g i 10-20 min till pellet DNA26.
- Arbetar på en arbetsbänk, Återsuspendera DNA pelleten i 1 mL av 0,1 mM TE buffert (pH 8,0). Filer suspensionen genom en kommersiell gel filtrering kolumn (som normalt används för polymeraskedjereaktion (PCR) städa upp) att eliminera salter och låg molekylvikt material som kan störa NGS.
- Analysera proverna av 1% agaros gel-elektrofores med etidiumbromid färgning för att visa kvaliteten på förberedelserna. Bedöma kvaliteten på DNA med en nanodrop spektrofotometer.
Obs: Ett förhållande av provet absorbansen vid 260 λ och 280 λ mellan 1,85 och 2.0 indikerar vanligtvis att preparatet är ”rent” av föroreningar och håller önskad kvalitet. - Analysera kvaliteten på DNA (Använd 5 pg till 10 ng) med ett chip baserade kapillärelektrofores instrument.
Obs: Kvalitet utdata visar ren toppar, som representerar DNA-fragment som distribueras av storlek längs en x-axeln. Topphöjden anger överflöd av fragmentet. Taggiga topparna indikerar delvis försämrad fragment eller kemiska föroreningar. Runda kurvor representerar ett utstryk av DNA som indikerar dålig kvalitet
2. bibliotek förberedelser med DNA och Emulsion-baserade klonal amplifiering (emPCR förstärkning)
Obs: Biblioteket vanligtvis tillagas av en NGS anläggning som utför kundorienterade arbete.
- Skeva en lösning av DNA (> 200 ng) med hjälp av en nebulisator som omvandlar DNA fragment. Ligera kommersiella adaptrarna enligt manualens instruktioner27.
- Utföra emPCR amplifiering av DNA-provet enligt tillverkarens instruktioner28,29,30. Upprepa tvättningen tre gånger, och efter varje tvätt, pellet pärlor i en minicentrifuge för 10 s. Kassera supernatanten efter varje tvätt.
Obs: Förfarandet börjar med förberedelse av fånga pärlor av tvätt i kommersiella tvättbuffert medföljer kitet. emPCR är vanligen används för mallen förstärkning för NGS. - Värme denaturering av DNA eller RNA vid 95 ° C i 2 min och sedan 4 ° C tills de ska använda. Använd 200 miljoner molekyler av DNA/RNA till 5 miljoner fånga pärlor i en slutlig volym av 30 µL. förbereda en mock prov vid sidan av DNA/RNA-prov och utföra följande steg med nukleinsyra provet samt håna provet.
- Utföra emulgering av vortexa röret emulsion olja för 10 s vid maximal hastighet, Häll hela innehållet (4 mL) i en plast omrörning röret som är kompatibel med en plattform Homogenisatorer. Placera omrörning röret på plattformen för att blanda emulsionen vid 2.000 rpm för 5 min.
- Dispensera 100 µL portioner av emulsion i 8-strip cap rör eller i en plattan med 96 brunnar. Cap rören eller försegla plattan och utföra emPCR med hjälp av tillverkarens rekommenderade program28.
Obs: Efter PCR är klar, kontrollera brunnarna för att se om emulsionen är intakt och sedan fortsätta. Kassera hela brunnen om emulsionen bryts. - Bära en labbrock och arbeta i en kemisk huva att samla de amplifierade DNA pärlorna (ADB). Vakuum aspirera emulsionen från brunnarna och samla pärlor i en 50 mL tub. Skölj brunnarna två gånger med 100 µL av isopropanol och aspirera sköljningen till samma 50 mL-röret.
- Vortex den insamlade emulsioner och resuspendera ADB med isopropanol till en slutlig volym av 35 mL. Pellet ADB vid 930 x g i 5 min. ta bort supernatanten och tillsätt 10 mL öka bufferten. Vortex ADB och sedan tvätta med isopropanol till 40 mL slutlig volym centrifug och Kassera supernatanten efter varje tvätta och upprepa tvättningen två gånger.
- Utföra en sista tvätt med etanol i stället för isopropanol. Lägg till öka buffert till 35 mL slutlig volym, vortex och pellet pärlorna på 930 x g för 5 min. avlägsna supernatanten men lämna 2 mL öka bufferten.
- Överför till en mikrocentrifug rör och centrifugera kort för att pellets ADB. Efter kasta bort supernatanten, skölj ADB pelleten två gånger med 1 mL öka bufferten. Centrifugera och Kassera supernatanten efter varje tvätt.
- För att förbereda för DNA bibliotek pärla anrikningen, tillsätt 1 mL 1 N NaOH till pärlorna. Vortex ADB och sedan Inkubera i 2 min i rumstemperatur. Centrifugera och kasta bort supernatanten. Upprepa detta tvätta en gång.
- Tillsätt 1 mL av glödgning buffert, sedan vortex ADB och inkubera i 2 min i rumstemperatur. Kort Centrifugera och kasta bort supernatanten. Upprepa detta steg igen med 100 µL av glödgning buffert.
- För att glödga sekvensering grundfärger till DNA, lägga till 15 µL av Seq Primer A och 15 µL av Seq Primer B i kit. Kort blanda genom vortexa och placera mikrocentrifug röret i ett värme block vid 65 ° C i 5 min. överföring till is i 2 min.
- Tvätta tre gånger med 1,0 mL av glödgning buffert. Virvel för 5 s och Kassera supernatanten varje gång.
- Innan sekvensering, mäta antalet pärlor med en kommersiell pärla räknare. Det bör finnas minst 500.000 berikad pärlor.
Obs: Räknaren pärla är en speciell anordning som mäter pärlorna i ett medföljande mikrocentrifug rör.
3. allmänna mRNA isolering och dsDNA syntes börjar med infekterade Canna lämnar som testar av RT-PCR för CaYMV använda rapporterade diagnostiska grundfärger
- Bära en laboratorierock och latexhandskar för personligt skydd i alla efterföljande steg. Arbetar på en arbetsbänk, samla 12 prover från bladen och störta proverna i flytande kväve. Använda en pärla kvarn för homogenisering. Använd en kommersiella kit som innehåller en kolumn-baserade standardmetod för hela plantan RNA isolering. Lägg till den guanidin-isotiocyanat lyseringsbuffert föreskrivs av kit till marken prov och skaka 20 s.
- Lägg till etanol och blanda väl, enligt instruktionerna till serverfaxsatsen. Lägga till varje Homogenatet en spin kolumn som binder RNA till membranet. Tvätta tre gånger och eluera RNA till en återhämtning tube24.
- Kvantifiera RNA med en spektrofotometer för att mäta förhållandet mellan absorbansen vid 260 λ och 280 λ. Verifiera RNA integritet med 1% agaros gel-elektrofores färgas med etidiumbromid.
Obs: En absorbans förhållandet mellan 1,85 och 2.0 indikerar att utarbetandet av önskad kvalitet. Behandla RNA med DNAS jag (10 µg/mL) under 10 minuter vid 37 ° C. Använda en kommersiell spin kolumn för att koncentrera RNA i RNase-fritt vatten31. Pool RNA prover innan du fortsätter. - Använd en rRNA borttagning kit att ta bort växten ribosomalt RNA. Alikvotens magnetiska pärlor till mikrocentrifug rör och tvätta två gånger vatten med RNase-gratis. Vortex röret alikvotens att resuspendera, placera röret på en magnetisk stå och vänta för vätska att rensa. Avlägsna supernatanten och ersätta med magnetiska pärla resuspension lösningen. Vortex Omsuspendera och lägga till 1 µL RNase Inhibitor.
Obs: Sådana kit använda oligo-dT bunden till magnetiska pärlor som hybridiserar till mRNA. Metoden använder standard magnet pärla separationsteknik för att återställa avskrifter24. - Kombinera 500 ng 1,25 µg RNA, RNase-gratis vatten och reaktion buffertar som tillhandahålls av satsen. Placera blandningen i 10 min vid 50 ° C. Ta bort från värmen och tillsätt tvättade magnetiska pärlor i RNAse gratis vatten. Vortex kort och set i rumstemperatur i 5 min.
- Placera på en magnetisk stå och vänta för vätskan att rensa. Överför supernatanten till ett färskt mikrocentrifug rör. Ställ in på isen.
- Använd en lösning-baserade capture metoden för anrikningen av exosomes och 200 ng av RNA att förbereda cDNA biblioteket.
Obs: Double strand cDNA biblioteket vanligtvis tillagas av en NGS anläggning som utför kundorienterade arbete. - Fragment RNA med hjälp av en kommersiell RNA fragmentering lösning (0.136 g ZnCl2 och 100 mM Tris-HCl pH 7.0). Tillsätt 2 µL lösning i 18 µL av RNA (200 ng totalt). Snurra rören kort i en mikrocentrifug, placera proverna vid 70 ° C i 30 s och överföring till is. Stoppa reaktionen med 2 µL 0,5 M EDTA pH 8,0 och 28 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5.
- Binda RNA till magnetiska pärlor genom att blanda i rumstemperatur i 10 min. Använd en magnetisk koncentrator att samla pärlor och kasta bort supernatanten. Tvätta pärlorna tre gånger med 200 µL av 70% etanol. Kassera varje tvätta och sedan lufttorka pelleterat pärlorna i rumstemperatur i 3 min. resuspendera i 19 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5.
- Glödga slumpmässiga primers fragmenterade RNA genom uppvärmning till 70 ° C i 10 min och sedan placera röret på is för 2 min. Förbered först strand och andra strand cDNA med en standard kommersiella cDNA syntes kit.
- Rena den dubbel-strand cDNA med hjälp av en magnetisk pärla koncentrator. Tvätta med 800 µL av 70% etanol tre gånger. Kassera varje tvätta och lufttorka pellets i rumstemperatur i 3 min. Återsuspendera i 16 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Använd Platskoncentratorn magnetiska pärla för att separera pärlorna från det dubbelsträngat cDNA, som nu är i lösning. Ta bort cDNA med pipett till en ny 200 µL PCR-röret.
- Genomföra fragmentet slut reparera med hjälp av Taq-polymeras och en blandning av deoxyribonucleotides som tillhandahålls av en kommersiell bibliotek förberedelser kit. Kommersiella kit ger pre utspädda adaptrar för att lägga till i varje ände av den dubbel-strand cDNA använder kommersiella ligase vid 25 ° C i 10 min.
4. NGS av DNA bibliotek beredd från rå Virus förberedelse och dsDNA bibliotek beredd från mRNA
- Använda ett standard hög genomströmning pyrosekvensering instrument och följa alla rekommenderade tillverkarnas protokoll för att generera direkt avläsning av DNA-sekvenser. Använd kommersiella sekvensering reagenser, inklusive fluorescently märkt nukleotider.
Obs: För detaljer, se tillverkarens instruktioner som medföljer instrumentet. - Bär ut efter sekvensering analys med hjälp av genomet montering programvara som automatiskt monterar läsningar för att producera den första uppsättningen av contigs med en genomsnittlig längd av < 700 bp. använda FastQC programvaran på webbplatsen iPlant/CyVerse, som utför kvalitetskontroll kontroller på raw sekvens data32. Välj sekvenser med Phred score ≥ 30 till fortsätta att rekonstruera längre sekvenser från mindre sekvensen läser24 kartläggning och amplikon programvara.
Obs: För detaljer, se tillverkarens anvisningar. - Skicka dessa monterade contigs NCBI-BLASTn analys använder MEGABLAST standard modul samt Viridplantae (TaxID: 33090) och virus (TaxID: 10239) som den begränsande organismers namn33. Samla subpopulationen av contigs som visar hög likhet rapporterade Badnavirus arvsmassan i en rapport.
- Kontrollera att de kopplade ställningar som representerar ett eller flera kandidat fullängds virus arvsmassa, korrekt producera i-frame-sekvenser som har samma organisation som standard badnavirus genomet. Gör detta genom att mata in kandidat full längd virusgenom i en plasmid ritprogram. Bekräfta sedan de första 15 nukleotiderna består av en tRNAuppfyllda (TGGTATCAGAGCGAG) som är mycket bevarad bland badnaviruses. Leta upp den potentiella polyadenylation signalen nära 3' slutet av genomet. Kommentera det fullständiga genomet för att identifiera närvaron av två små ORFs och en stor ORF kodning en polyprotein. Sedan använda portalen ExPASy översätta verktyg för att identifiera badnavirus ORF1, ORF2 och ORF3 översättning produkter34.
Obs: Denna vetenskapliga programvara är gratis och kommer att generera cirkulär DNA, identifiera alla öppna läsning ramar och ger en omedelbar effekt för att kontrollera att sekvensen representerar den fulla längd Cirkulärt DNA-gen. - Använd öppen källkod flera sekvens jämförelseverktyg, muskel- och CLUSTALW, för att jämföra virus genomen erhållits från DNA och RNA analyser35,36.
- Sök i NCBI nukleotid-databasen för att få den fullständiga genom sekvenser av 30 badnavirus arter och exportera dem som ett dokument i .fasta format. Ladda upp sekvenser till en programvara som genomför evolutionära genetisk analys av sekvenser tillsammans med virus arvsmassa sekvenser erhålls genom NGS. Generera flera sekvens linjeföring och högsta sannolikheten träd med muskel37.
5. kvalitetsbedömning av De Novo sekvensering av PCR-amplifiering av Virus genom från infekterade plantor
- Mata in nyligen identifierade fullängds badnavirus genomet sekvenser (.fasta format) till gratis online Primer3 verktyget att härleda PCR primers38. Identifiera primer uppsättningar som kommer att producera vacklade produkter av 1.000-1.500 bp längs hela längden av den virus genome(s). Skicka sekvenser till en serviceverkstad som kommer att syntetisera och leverera PCR primers.
Obs: Utdata identifierar godtagbar primer par med gemensamma och acceptabel smälttemperaturer och precisa primer platser längs den introducerade sekvenser. - Arbetar på en arbetsbänk och bär en labbrock och handskar, isolera 5 µg av DNA från virus-infekterade och frisk kontroll bladen med en automatiserad metod som innebär standard paramagnetiska cellulosa partiklar för att isolera DNA från plant material39 . Frysa blad material (20-40 mg) i flytande kväve i en mikrocentrifug rör och slipa med en pärla kvarn. Kombinera provet med lyseringsbuffert i en mikrocentrifug rör och lägga RNase A till varje prov. Vortex provet för 10-20 s och kort snurra provet ta bort fasta partiklar.
Obs: Paramagnetiska cellulosa partiklar har hög DNA-bindande kapacitet och isolera hög avkastning i ren DNA. De vanliga kommersiella kiseldioxid kolumn metoderna för DNA isolering inte effektivt extrahera DNA från en mängd olika växtarter. Följaktligen finns massor av metoder som är ändringar av dessa förfaranden för att förbättra effektiviteten för enskilda växtarter. Den automatisera paramagnetiska cellulosa partikel metoden valdes eftersom det ger mer och högre kvalitet DNA från mer än 25 örtartade angiosperm arter40. - Använd kommersiella reagens patroner för automatiserad paramagnetiska DNA isolering. Tillsätt 300 µL nuclease gratis vatten till varje kommersiell reagens patron och överföring anläggning lysate till samma patron. Placera kassetten i patronen rack, placera en kolv i väl närmast till eluering röret och placera eluering buffert i eluering röret. Ladda patroner i automatiserade nukleinsyra isolering maskinen och köra anläggningen DNA isolering protokoll41,42.
- Utföra PCR att härleda en uppsättning av överlappande PCR-produkter. Använd 5 µM varje framåt och bakåt grundfärg med 35 cykler av PCR-amplifiering. Använd följande cykling villkor: denaturering vid 95 ° C i 60 s, glödgning vid 50 ° C för 45 s, och förlängning vid 72 ° C under 1-2 minuter med en sista förlängning vid 72 ° C för 7-10 min. Använd en förpaketerad gel filtrering kolumn att eliminera salter och låg molekylvikt material som i steg 1.231.
- Beräkna förhållandet 3:1 molar av PCR-produkten till vektor för att bestämma mängden av PCR-produkten att ligera till 50 ng linearized pGEM plasmid43. Använda en kontroll infoga DNA för att avgöra om nering fungera effektivt. Utföra den ligering över natten med T4 DNA-ligase (3 U/µL) vid 4 ° C. Sedan omforma kommersiellt beredd JM109 behöriga Escherichia coli celler. Använd kontrollera 100 pg av uncut plasmid DNA som positiv kontroll för effektiv omvandling. Skylt 100 µL av celler på LB-agarplattor med antibiotikum och blå/vit markering att återställa sammanskrivna plasmider26. Inkubera plattorna för 16-24 timmar vid 37 ° C.
Obs: PGEM vector har en Lindholm-gen som kodar β-galaktosidas. Transformerade bakterier odlas på en platta blir som innehåller 100 µg/mL ampicillin, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) blå på grund av β-galaktosidas aktivitet. PGEM plasmiden är linearized på ett sätt som stör Lindholm genen. Kolonier som innehåller PCR-produkt skären störa genen Lindholm och metabolisera inte X-gal. Dessa kolonier är vita. Kolonier med en insats kan således skiljas från dem utan en Infoga av färgen på den koloni (vit kontra blå)26. - Isolera DNA från tre kolonier med en standard kolumnbaserade plasmid isolering kit39. Sekvensera tre plasmider omvandling produkt. Jämföra varje DNA-sekvensen med de novo monterade virus genomen produceras av NGS. Använd CLUSTALW att justera sekvenser och se till att de beställs på lämpligt sätt.
Representative Results
Denna modifierade viruset reningsmetod som tillhandahålls en anrikning av virus DNAs användbara för att identifiera två virus arter av NGS och bioinformatik. Efter Homogenatet var centrifugeras vid 40 000 x g för 2,5 h, fanns det en grön pellets på botten av röret och en vit pellet längs längden. Den gröna pelleten var resuspended i en mikrocentrifug rör och vita pelleten var resuspended i två mikrocentrifugrör. PCR utfördes med hjälp av standard CaYMV PCR diagnostiska primers och produkter upptäcktes i solubilized vita pelleten och inte gröna pelleten (figur 1A). Ett prov av rå preparatet undersöktes av transmissionselektronmikroskopi och vi observerade bacilliform partiklar mäta 124-133 nm i längd (figur 1B). Detta är inom förutsedda modala längden på de flesta badnaviruses. DNA var utvinns ur de vita och gröna pelletarna och resuspended separat. I figur 1C, vi lastade 5 µL av DNA extraheras från gröna och vita pellet prov (1,6 µg av DNA för den gröna delen) och 3,1 µg DNA för den vita fraktionen till 0,8% agaros gel elektrofores och analyserat DNA efter etidiumbromid färgning. Den gröna delen innehöll låg molekylvikt DNA medan den vita fraktionen producerat två band av högre molekylvikt DNA, samt den lägre molekylvikten DNA (figur 1C). Den gel som presenteras i figur 1C kördes för 40 min vid 100 V och utstryket i lane 3 föreslår att gel spänningen sänkas till producera tydligare band. Dessa data tyder på att den vita pelleten berikas för virioner. DNA (0,6 µg/mL) koncentrationen utvinns ur vita provet var låg, men tillräcklig för NGS, som kräver ett minimum av 10 ng DNA att gå vidare. Fragmenterade DNAs användes för att förbereda ett bibliotek för NGS.
Parallellt extraherades RNA från infekterade canna växter (figur 1D) för hög genomströmning RNA-följande punkter Ett standardarbetsflöde genomfördes för bibliotek förberedelse, NGS, skapa contigs och identifierar virusgenom sekvenser (figur 1E). Utdata resultaten från med hjälp av DNA och RNA som utgångsmaterial jämfördes.
Vi fick 188,626 raw DNA-läsningar av NGS använder DNA isolerade från rå virus förberedelse. Läsningar monterades i 13,269 contigs och BLASTn användes för att söka NCBI datamängden av nukleotidsekvenser (med Viridplantae TaxID: 33090 och Virus TaxID: 10239 som de begränsande organismerna) (figur 1E). NCBI-BLASTn resultaten avslöjade att 93% av de novo monteras contigs var cellulära sekvenser, 22% var okända, och 0,3% var virus contigs (figur 2A). Majoriteten av contigs kategoriseras som cellulära sekvenser identifierades som mitokondrie eller kloroplast DNA. Inom datamängden av virus contigs, 32% av de virus contigs var relaterade till medlemmar i Caulimoviridae (som inte var Badnavirus sekvenser) och 58% av dessa var relaterade till Badnavirus. Av de virus contigs, 29% var mycket liknande (e < 1 x 10-30) till CaYMV isolera V17 ORF3 gen (EF189148.1), sockerrör bacilliform virus isolera Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1), och Banana strimma CA virus slutföra genomet ( KJ013511). Inom denna population fanns det långa contigs som liknade två fullängds genomer.
Hög genomströmning RNA-seq producerade 153,488 rengjorda enskilda sekvens läser med i genomsnitt läsa < 500 bp. Contig montering längd minskas detta till 8,243 contigs. Dessa överlämnades till NCBI-BLASTn (använder Viridplantae TaxID: 33090 och Virus TaxID: 10239 som de begränsande organismerna) och utgångarna placerats 76% av contigs i en kategori av växten cellulära sekvenser, 23% var okänd, och 0,1% var Kategoriserad som virus contigs ( Figur 2 B). närmare granskning av befolkningen av 0,1% befolkningen av viruset contigs fastställs att 68% av dessa tilldelades till Caulimoviridae (bild 2B). Tre stora contigs inom denna population identifierades med hög likheten (e < 1 X 10-30) till CaYMV isolera V17 ORF3 gen (EF189148.1), sockerrör bacilliform virus isolera Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1) och Banana strimma CA-virus komplett genomet (KJ013511). Att granska de tre contigs gick vi manuellt två av dessa att producera en fullängds virusgenom.
Vi jämförde den virus arvsmassa längd contigs producerad av DNA och RNA-sekvensering som en ömsesidig byggnadsställning till förekomsten av två fullängds virus arvsmassa. Ena hellångt virusgenom av 6 966 bp hette preliminärt Canna gul mottle associerade virus 1 (CaYMAV-1) (figur 3A). Det andra genomet var 7.385 bp och en variant av CaYMV som infekterar Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (figur 3A).
Slutligen användes PCR primers som var avsedda att klon ~ 1000 bp fragment av varje virus differentially upptäcka båda arvsmassan i en population av 227 canna växter som representerar nio kommersiella sorter. I många fall var enskilda växter infekterade med båda virusen. Vi ger ett exempel på RT-PCR-detektion av CaYMAV-1 och CaYMV-Ap01 i 12 växter. Tre av dessa var positiva endast för CaYMV-Ap01 och nio var positiva för både virus (figur 3B).
Figur 1 : Virus nukleinsyra preparat och NGS arbetsflödet. (A) agaros (1,0%) gel elektrofores av 565 bp PCR-fragmenten av CaYMV genom. Två PCR produkter upptäcktes i prover beredd från vita pelleten (körfält 1, 2) men inte i gröna pellet provet (lane 3). Positiv kontroll (+) representerar en PCR produkt amplifierats från smittade anläggningen DNA som isolerades med hjälp av en automatisk metod som inbegriper standard paramagnetiska cellulosa partiklar. Lane L innehåller DNA stege används som standard för att mäta storleken på linjära DNA band i provet körfält. (B) exempel på virus partikel ses av transmissionselektronmikroskopi i vit pelleten återkrävas av rå fraktionering av infekterade canna blad. (C) agaros (0,8%) gel elektrofores av DNA som återhämtat sig från gröna (lane 1) och vit (lane 2) pellets som testat positivt med PCR i panelen A. Röda och gula prickar bredvid lane 2 identifiera två hög molekylvikt DNA band som uppstår i det vita bråket. (D) agaros (1%) gel elektrofores av total-RNA återvinns genom kolumnbaserade RNA rening. Lane L innehåller DNA stege används som standard för att mäta storleken på linjär band i provet körfält. Lane 1-6 innehåller RNA isoleras från infekterade canna blad som var samman till ett enda prov för ribo- och RNA-följande punkter (E) Schematisk pipeline av nukleinsyra isoleringar, bibliotek förberedelse, sekvensering, contig församling och virusgenom upptäckten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kronan diagram visualisera de taxonomiska grupper av contigs. (A) diagrammet till vänster visas på överflöd och taxonomiska distribution av contigs monteras från rå virus förberedelse. Rätt diagramtyp skildrar proportionerna av viruset contigs associerade med familjen Caulimoviridae , Badnavirus släkte och tre nära besläktade arter. (B) panelen till vänster visar överflödet av contigs härrör från RNA-seq baserat på deras taxonomiska fördelning. Till höger är grafen som skildrar överflödet av contigs inom befolkningen av viruset contigs associerade med familjen Caulimoviridae , Badnavirus släkte och tre nära besläktade arter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Karakterisering av CaYMAV-1 och CaYMV-Ap01 genomen. (A) schematisk representation av Canna gul mottle associera virus 1 (CaYMAV) och Canna gul mottle virus liknar genomet isolerade från Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid positioner 1-10 identifieras som början av genomet och innehåller en tRNAuppfyllda anticodon webbplats typiska för de flesta badnavirus genomen. Stopp och start positionerna för översättning av öppen läsning ram (ORF) 1 och 2 är intilliggande. Dessa proteiner har okända funktioner. ORF3 är ett polyprotein innehållande zink finger (ZnF), proteashämmare (Pro), omvänt transkriptas (RT) och RNAse H domäner. En 3' poly(A) signal sekvens är bevarad för båda virus arvsmassa. (B) RT-PCR-analys utfördes med RNA isoleras från virus infekterade blad och primers som upptäcker CaYMAV och CaYMV-Ap01. I samma population av 12 växter, var tre infekterade med CaYMV-Ap01 endast, medan resterande var infekterade med både CaYMAV och CaYMV-Ap01. (+) indikerar positiv kontroll och (-) anger negativ kontroll. Denna siffra är reproduceras/modifierat från Wijayasekara et al. 24 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Under de senaste åren en mängd metoder har använts för att studera växt virus biologisk mångfald i naturliga miljöer som omfattar berikande för virusliknande partiklar (VLP) eller virus specifika RNA eller DNA2,3,44, 45,46 . Dessa metoder följs av NGS och bioinformatisk analys. Målet med denna studie var att hitta kausala agenten av en vanlig sjukdom i en odlad växt. Sjukdomen uppgavs vara resultatet av ett okänt virus som har icke-höljebärande bacilliform partiklar, och som endast ett 565 bp fragment har varit klonade47. Denna information var tillräckligt för tidigare forskare hypotetiskt tilldela viruset till släktet Badnavirus i familjen Caulimoviridae. Medan tidigare rapporter hypotesen att canna mottle sjukdom i canna liljorna var resultatet av en enda badnavirus, använder det metagenomik synsätt som beskrivs i denna studie var vi fast beslutna att sjukdomen orsakades av två trevande badnavirus arter24. Styrka med en metagenome metod för att upptäcka kausala agenten av en sjukdom är således, att vi nu kan identifiera situationer där det kan finnas mer än en orsak.
Vår strategi som kombinerar DNA och RNA-sekvensering data är grundlig och visar också att resultaten med hjälp av två metoder gav konsekvent resultat och bekräftat förekomsten av två relaterade virus. Vi anställda ett modifierat förfarande för isolering av caulimoviruses och producerat ett prov som var berikad för virus associerade nukleinsyror och som skyddades inom virus kapsid. En service laboratory kontrakterades för att genomföra DNA-sekvensering. Det grundläggande konceptet för de novo sekvensering är att DNA-polymeras inlemmar den fluorescerande märkt nukleotider i en DNA mall strand under sekventiell cykler av DNA-syntes. Contigs monterade följt av NGS lämnades in till ett bioinformatiska arbetsflöde producerar några contigs som identifierades som virus contigs. Ytterligare bekräftelse av två virus genomen10,24,48,49,50 erhölls genom bioinformatiska analyser av RNA-seq uppgifter som erhållits från ribo-utarmat RNA preparat. Ett intressant resultat var att lära sig att populationerna av sekvenser återkrävas av DNA och RNA-sekvensering föreskrivs liknande distributioner av icke-virala och viral nukleinsyra. För DNA och RNA-sekvensering var < 0.5% av sekvenser av virus ursprung. Inom befolkningen av virus sekvenser 78-82% tillhörde familjen Caulimoviridae. Genom att jämföra den monterade virus contigs från DNA och RNA-sekvensering, bekräftade vi att två monterade genomen inträffade i både datamängder.
Ett bekymmer med att använda endast DNA-sekvensering för att identifiera nya virus genomen är att badnavirus genomet är en öppen cirkulär DNA. Vi anade att sekvenser överlappande diskontinuiteter i genomet kan utgöra hinder för genomet montering från contigs. Första undersökning av DNA sekvensering resultatet visade två liknande virus arvsmassa. Vi hade en hypotes att dessa genomen antingen representerade genetiska mångfalden av arter som inte har studerats, eller representerade två arter Co infektera samma växt24. Därför, den kollektiva bioinformatiska analysen av datamängder som erhålls genom NGS DNA och RNA-sekvensering, aktiverat bekräftelse av förekomsten av två fullängds genomer.
Det finns en annan rapport som utvecklat en alternativ metod för att extrahera VLP och nukleinsyra från växten homogenates för gjorts studier, utifrån rutiner att återvinna DNA från blomkålsmosaikviruset (CaMV; en caulimovirus)3. Denna strategi identifieras roman RNA och DNA-virus sekvenser i icke-odlade växter. De steg som härrör från förfarandet caulimovirus isolering används i denna studie för att upptäcka kausala agenten en sjukdom av kulturväxter är till skillnad från stegen härrör för att extrahera VLP från naturligt infekterade plantor24. Framgången för båda ändrade metoderna föreslår att förfarandet för caulimovirus isolering kan vara en värdefull utgångspunkt för gjorts studier av växten virus i allmänhet.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Forskningen har finansierats av Oklahoma Center för befordran av vetenskap och teknik tillämpad forskning Program fas II AR 132-053-2; och av Oklahoma Institutionen för jordbruk specialitet grödor forskning Grant Program. Vi tackar Dr. HongJin Hwang och OSU bioinformatik Core Facility som stöddes av bidrag från NSF (EOS-0132534) och NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 och 5P20RR15564-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
| urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
| Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
| Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
| MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
| EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
| Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
| phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
| DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
| 95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
| Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
| Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
| Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
| Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
| Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
| 2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
| 2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| 2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
| RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
| RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
| rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
| RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
| pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
| pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
| dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
| PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
| Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
| PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
| pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
| MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
| Primer 3.0 | Simgene.com | ||
| Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
| GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
| GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
| GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
| IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
| IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
| GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
| GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
| GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
| Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
| GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
| GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |
References
- Dijkstra, J., Jager, C. P. Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).
- Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
- Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
- Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
- Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
- Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
- Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).
- Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
- Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
- Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
- Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
- Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
- Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
- Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
- Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
- Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
- Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
- James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
- Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
- Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
- BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).
- Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
- Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
- Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).
- Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
- Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
- Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
- Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
- Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
- Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
- Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
- Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Grooms, K. Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
- Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
- Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. Plant Virus Evolution. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).
- Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
- Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Plant Health Progress. , Online (2004).
- Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).
- Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
- Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).
