Summary

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

Published: June 19, 2018
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Summary

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Abstract

A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3′ de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3′ da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3′ lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5′-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.

Introduction

As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.

Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combinação com análises densitométricos do autoradiograms ou do fósforo de imagem8,9,10 tem sido tradicionalmente usados para detectar a atividade de revisão de DNA polimerases. Embora funcional, estes ensaios são trabalhoso, caro e não passível de formatos de alta produtividade. Além disso, radioisótopos sofrem de problemas de segurança, incluindo a eliminação de resíduos. Alternativamente, as atividades de revisão foram analisadas por técnicas fluorométrica. Por exemplo, 2-aminopurina (2-AP) pode ser incorporado em produtos de extensão durante a polimerase em vitro revisão ensaios para produzir um sinal fluorescente11,12. Infelizmente, essas abordagens sofrem uma baixa especificidade, desde 2-AP pode emparelhar com timina e citosina. Abordagens mais recentes incluem uma sensível baseados em G-quadruplex luminescente ligar sonda para um polymerase 3′ – 5′ exonuclease ensaio13 , bem como uma sonda fluorescente-etiquetadas individualmente para um polymerase revisão ensaio que supera alguns do desvantagens acima de14. Entusiasmo para esses métodos fluorométrica é diminuído devido à necessidade da rotulagem específica de substratos de DNA.

Em contraste, uma MALDI-TOF MS para análise de DNA tem sido utilizada no ensaio de PinPoint, onde as reações de extensão da primeira demão com 4 ddNTPs sem rótulo podem ser usadas para identificar polimorfismos em um determinado locus15,16,17 e foi adotado extensamente em aplicações clínicas para a detecção de mutações e câncer diagnostica18. Usando estes princípios básicos, nós criamos um rótulo livre ensaio para a determinação em vitro da DNA polimerase revisão atividade explorando a alta resolução, alta especificidade e potencial de alto rendimento de MALDI-TOF MS. usando o E. Coli DNA polimerase eu Klenow fragmento como uma enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como substratos podem tomar um “instantâneo” de revisão de produtos depois de um único nucleotídeo extensão através de MALDI-TOF MS (Figura 1).

Da mesma forma, este método também foi desenvolvido para um ensaio de reparo de DNA onde cartilhas contendo 3′ penúltimo dI lesões são submetidas a uma pol que reparar o ensaio que imita endo V roubada reparação intermediários. Enquanto não são totalmente conhecidas, o caminho de reparação endo V é o único sistema de reparação conhecido para empregar o pol eu revisão atividade do exonuclease para excisão de lesão19,20. Usando o MALDI-TOF MS, mostramos um remendo de reparação claramente definidos onde dI pode ser extirpado por pol eu quando ocorrem no último 2 nt do primer antes de adicionar o nucleotídeo complementado correto.

Para o estudo de revisão e reparação do ADN, este método é mais rápido e menos trabalhoso do que métodos anteriores e fornece informações adicionais para o mecanismo e função.

Protocol

1. modelo de primer/preparação Projetar primers/modelos com um conteúdo de G + C equilibrado entre 40% e 60% como em uma sequência ou projeto da primeira demão PCR. Use as primeiras demão de 18 a 21 nt para um recozimento apropriado e melhores sinais de MS. O modelo de design, definindo a 50 ° C como o mínimo de temperatura para a região de frente e verso pelo menos 7 de fusão nt de 5′-saliência para separar os sinais entre o primer e o modelo.Nota: por exemplo, para o substrato P21/T28…

Representative Results

Primers e modelos: Usando o procedimento apresentado aqui, igual modelos molar do oligonucleotide sintéticas e primers de sequências relevantes obtidas de fontes comerciais foram verificadas por sua pureza e qualidade (Figura 3A; note que os sinais combinados a massa designada e o baixo fundo) bem como para a relação entre o pico de intensidade e a massa do analito (<strong clas…

Discussion

Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análise…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a facilidade do núcleo integrado NCFPB genômica funcional (Taipei, Taiwan) e o laboratório de farmacogenômica NRPB (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação de saúde de Taiwan (L-Il) e o Ministério da ciência e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [mais 105-2320-B-002-047] para Hu Wei-Yao, [mais 105-2628-B-002-051-MY3] para Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] por Liang-na Lin.

Materials

Oligonucleotides Mission Biotech (Taiwan) 
phosphorothioate modified oligonucleotides  Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs, MA M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs, MA M0212L
NEBuffer 2.1 (10X) New England Biolabs, MA B7202S
2', 3' ddATP Trilink Biotechnologies, CA N4001
2', 3' ddGTP Trilink Biotechnologies, CA N4002
2', 3' ddTTP Trilink Biotechnologies, CA N4004
2', 3' ddCTP Trilink Biotechnologies, CA N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set Clubio, Taiwan CB-R0315
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509
MassARRAY   Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145
Clean Resin Tool Kit   Agena Bioscience, CA #08040

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Su, K., Goodman, S. D., Lai, H., Yen, R., Hu, W., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Fang, W. Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57862, doi:10.3791/57862 (2018).

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