Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile
Summary
DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.
Abstract
Genom ve onun sadık çoğaltma bakım genetik bilginin korunması için her şeyden önemlidir. Yüksek sadakat çoğaltma değerlendirmek için basit bir sigara etiketli geliştirdiğimiz ve radyo izotopik yöntemi bir matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman–uçuş ile (MALDI-TOF) kullanarak kütle spektrometresi (MS) analiz proofreading bir çalışma için. Burada, bir DNA polimeraz [Örneğin, Escherichia coli DNA polimeraz Klenow parçası (KF) ben (pol ben) Bu çalışmada] huzurunda tüm dört dideoxyribonucleotide trifosfatlar arasında eşleşmeyen astar şablonu çift yönlü işlemek için kullanılır. Eşleşmeyen astar sonra yazım denetimini/genişletilmiş ve MALDI-TOF MS için tabi. Ürünler tek nükleotid varyasyonları aşağı astar kitle değişikliği tarafından ayırt edilir. Önemlisi, bir yazım denetleme da iç tek uyuşmazlıklar için farklı verimliliği de olsa, belirlenebilir. 2-4-nükleotit (nt) 3′ uçtan bulunan uyuşmazlıklar vardı verimli pol tarafından tashih ve 5’te bir uyumsuzluk astar terminus NT’den yalnızca kısmi bir düzeltmesi gösterdi. Hiçbir yazım denetleme için astar 3′ sonundan itibaren 6-9 nt bulunan iç eşleşmeme durumu oluştu. Bu yöntem ayrıca DNA onarım deneyleri (yüzeylerde endo V onarım yolu için Bankası-lezyon onarımını değerlendirmekÖrneğin, ) uygulanabilir. 3′ sondan bir önceki deoxyinosine (dı) lezyonlar içeren astar pol tarafından düzeltilmiş ben. Nitekim, sondan bir önceki T-ı, G-ben ve A-ben yüzeylerde vardı son 2 dI içeren nükleotit eksize pol tarafından ben bir doğru ddN 5′-monofosfattır (ddNMP) eklemeden önce sondan bir önceki C-ben uyuşmazlıkları pol tarafından tolere ben ilk olmadan genişletilmesi için izin , DNA tamiri ölçmek için duyarlılık ve kararlılık-in belgili tanımlık Bayan tahlil gösteren onarın.
Introduction
DNA polimeraz DNA ikileşmesi sırasında okuma fonksiyonları yüksek sadakat Döl1,2,3,4‘ eaktarılması gereken genetik bilgi sağlamak için gerekli olan, 5,6,7. Eksonükleazlar proofreading polimeraz katkıları değerlendirmek için güçlü olmak genetik istikrarı koruma mekanizmalarını açıklamak.
Radyoizotop etiketleme ve jel tabanlı deneyleri autoradiograms veya fosfor görüntüleme8,9,10 densitometric analizleri ile birlikte geleneksel olarak DNA’ın prova-okuma etkinliği tespit etmek için kullanılmıştır polimerazlar. Fonksiyonel, bu deneyleri zahmetli, pahalı ve yüksek üretilen iş biçimleri için müsait değil iken. Buna ek olarak, radioisotopes atık dahil olmak üzere güvenlik sorunları muzdarip. Alternatif olarak, prova-okuma etkinlikleri Fluorometrik tekniklerle analiz edilmiştir. Örneğin, 2-aminopurine (2-AP) vitro polimeraz deneyleri bir floresan sinyal11,12üretmek için yazım denetleme sırasında uzantılı ürünler dahil edilebilir. Ne yazık ki, 2-AP-ebilmek çift timin ve sitozin ile bu yana bu yaklaşımların bir düşük özgüllük acı. Daha yeni bir yaklaşım içerir bir hassas G-dörtlüsü tabanlı Işıksaçan anahtarı üzerinde prob bir polimeraz 3′ – 5′ eksonükleaz aktivitesi tahlil13 yanı sıra bazı üstesinden tahlil proofreading bir polimeraz için tek etiketli floresan sonda Yukarıda belirtilen sakıncaları14. Fluorometrik bu yöntemler için coşku belirli DNA yüzeylerde etiketleme için ihtiyaç nedeniyle azalır.
Buna ek olarak, bir MALDI-TOF MS DNA analizi için nerede astar uzantısı reaksiyonlar etiketlenmemiş 4 ddNTPs ile verilen locus15,16,17 polimorfizmleri tanımlamak için kullanılabilir belirlemekte tahlil istihdam ve mutasyon tespitleri için klinik uygulamalarında yaygın olarak benimsenmiştir ve kanser tanı18. Bu temel ilkelerini kullanarak, biz bir etiket içermeyen tahlil DNA polimeraz yüksek çözünürlük, yüksek özgüllük ve MALDI-TOF Bayan kullanma E. yüksek üretilen iş potansiyelini istismar etkinlik düzelti vitro belirlenmesi için oluşturduk coli DNA polimeraz ben Klenow parçası bir model enzim, dideoxyribonucleotide trifosfatlardan (ddNTPs) gibi yüzeylerde bir “anlık görüntü” bir tek nükleotid uzantısı üzerinden sonra MALDI-TOF MS (Şekil 1) ürünleri proofreading alabilir.
Aynı şekilde, bu yöntem aynı zamanda nerede hangi taklit eder endo arakladım V onarım ara ürün içeren 3′ sondan bir önceki dI lezyonlar ı onarmak bir pol tabi olan astar tahlil bir DNA onarım tahlil için geliştirilmiştir. Değil tam olarak anlaşılmış olsa da, endo V onarım pol benimçalışanlarımdan eksonükleaz aktivitesi lezyonu eksizyonu19,20proofreading için bilinen tek tamir sistemi yoludur. MALDI-TOF MS kullanarak, biz açıkça tanımlanmış onarım yama nereye dI pol tarafından eksize göstermek ben ne zaman son 2 meydana gelen nt doğru çıkarılan nükleotit eklemeden önce astar.
Proofreading ve DNA tamiri çalışma için bu yöntem daha hızlı ve önceki yöntemlerine göre daha az zahmetli ve mekanizması ve işlev doğru ek bilgi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada bir adım adım prova-okuma etkinliği tahlil tarafından seçilen ticari araç analiz açıklanan ( Tablo reçetesigörmek) MALDI-TOF MS kullanarak. Büyük avantajı astar ve şablon etiketi gerçekleştirmek için ücretsiz ve kolay olduğunu deneyler tasarımı daha fazla esneklik için izin içerir. Bir akış-kireç tam işlem testleri proofreading 30 4 h 3 h proofreading reaksiyonlar el ile gerçekleştirmek için de dahil olmak üzere, alacağını ve onların Temizleme sırasınd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İşlevsel Genomik (Taipei, Tayvan) ve teknik destek için NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Tayvan) için NCFPB entegre çekirdek tesis teşekkür ederiz. Bu eser Tayvan Sağlık Vakfı (L-I.L.) ve Bakanlığı Bilim ve teknoloji, Taipei, Tayvan, ROC [en 105-2320-B-002-047] Wei-Yao Hu için gelen araştırma hibe tarafından desteklenen [en 105-2628-B-002-051-MY3] Kang-Yi Su ve [için most-105-2320-b-002-051-my3] Liang bileşenini Lin için.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Riferimenti
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochimica. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
