אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal
Summary
הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.
Abstract
קהילות חיידקי המעית נקבעו בשלב מוקדם בחיים ולהשפיע על התפתחות תאי המערכת החיסונית ותפקוד. Microbiota neonatal חשופה להשפעות חיצוניות רבות, כולל שימוש אנטיביוטיקה, דיאטה, אשר משפיעה על הרגישות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. הפרעות כגון דלקת המעי המחלה (מחלת המעי הדלקתי) מאופיינים על ידי המאסיבית של תאים חיסוניים למעיים. עם זאת, תאים חיסוניים מותנה microbiota אולי בנוסף להגר מחוץ למעיים. להשפיע על תגובות חיסוניות באתרי אקסטרה מעיים. לפיכך, יש צורך לזהות ולאפיין תאים עשויים להעביר מסרים חיידקים מהמעיים לאתרים דיסטלי. כאן, אנו מתארים שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ויוו המאפשרת את הזיהוי שלהם באתרי אקסטרה מעיים לאחר ההעברה.
Introduction
מערכת העיכול יונקים בנמלים מאות מינים של חיידקים הקיימים במערכת יחסים סימביוטיים עם מארח1. תאים חיסוניים נוכח הסביבה המקומית שבה התרחשה לאכוף שוחר שלום עם החיידקים האלה ולהקים מחסום הגנה מפני פלישות הפתוגן. לפיכך, דו-כיוונית אינטראקציות בין תאים חיסוניים את microbiota הם קריטיים להקים קהילה commensal אשר מחנך את מערכת החיסון של הפונדקאי ומגדיר את סף תגובתיות מערכת החיסון פתוגנים. שינויים בשירותים מיקרוביאלי, או dysbiosis, להפריע את המערכת החיסונית הומאוסטזיס ואת perturb מעגלים רגולטוריות לרסן דלקות מעיים המוביל בתיווך החיסון למחלות כמו סוכרת מסוג 1, מחלת המעי הדלקתי2,3 .
תקופת מיד לאחר הלידה הוא חלון התפתחותי ייחודי שבמהלכו הקהילות מיקרוביאלית מעיים להתחיל להקים בו זמנית את מערכת החיסון מבשילה4. Microbiota לאחר הלידה אינה יציבה, עם משמרות הרכב הקהילה המתרחשים באופן טבעי, לעתים קרובות5. תאים חיסוניים המקיימים אינטראקציה עם microbiota שוכנים שני אנטומי מקומות נפרדים במעי – את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי6. סוגים רבים של תאים חיסוניים נמצאים המעי, כולל לימפוציטים (כגון תאי T, תאים B ומולדת בתאי הלימפה) כמו גם התאים מיאלואידית (הכוללות תאים דנדריטים, ומונוציטים ו מקרופאגים). תאים אלה, ידוע גם בתאי hematopoietic, לבצע מספר רב של פונקציות לשמר את מחסום המעי ולשמור הומאוסטזיס.
בנוסף פונקציות התקינה שלהם באתרים מעיים, תאי המערכת החיסונית של רירית עשוי גם להעביר מסרים מיקרוביאלי לאתרים מעיים במיוחד כדי לווסת את החסינות מערכתית-7,–8,–9. זהו אזור גידול מחקר מעניין והוא מדגיש את הצורך שיטות לזהות תאים חיסוניים נודדים מתוך הרקמות מעיים על מנת לחקור את תפקידם. פרוטוקול דיווח כאן מנצל דגם העכבר זמינים מסחרית שבה החלבון הניאון photoconvertible הוא מנוצל לתאים תווית. פאםטוחנות עכברים מביעים ubiquitously של חלבון פלואורסצנטי ירוק Dendra2 זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על הפעלה על ידי אולטרה סגול (UV) אור10. באמצעות הצינורית אופטיים סיבים כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך המעי הגס של עכברים היילוד, נדגים כי ניתן למצוא תאים hematopoietic photoconverted, אשר מקורו או transited דרך המעי הגס הטחול.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי ואפיון של תאים אינטראקציה עם והם מושפעים את microbiota במעי הגס הם חשובים, צריך להקל על ההבנה של איך מועבר מידע microenvironment הרירית לשאר חלקי הגוף. שיטה אחת ללמוד נדידת תאים הקשורים הבטן דורש את הבידוד של תאים הקשורים בטן ואחריו העברה המאמצת לתוך עכברים הנמען כדי לקבוע דפוסי רקמה-יונת שלהן לת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain נתמכה על ידי NIH/NIAID הקריירה המעבר פרס 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Altro | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Riferimenti
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
