Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의
Summary
여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.
Abstract
장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6장 상피에서 상주 합니다. 수많은 종류의 면역 세포 (수지상 세포, monocytes, 대 식 세포 등) 골수성 세포 뿐만 아니라 림프 톨 (T 세포, B 세포, 타고 난 림프 세포 등)을 포함 한 소장에 있습니다. 이러한 세포, 조 혈 모 세포로 알려진 다양 한 장 벽을 유지 하 고 항상성 유지 기능을 수행 합니다.
그들의 규정 하는 기능 장의 사이트에서 뿐만 아니라 점 막의 면역 세포 조직의 면역7,,89규제 미생물 메시지 여분 장 사이트를 반입할 수 있습니다. 성장 연구 관심 분야 이며 그들의 기능을 조사 하기 위해 장 조직을 마이그레이션할 면역 세포를 식별 하는 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기 보고 프로토콜 레이블 셀에 photoconvertible 형광 단백질은 악용 상용 마우스 모델을 이용 한다. 팜과excised 쥐 편은 레스터 전환 활성화 시 빨간색 형광 자외선 (UV) 빛10녹색 형광 Dendra2 단백질을 표현 한다. 섬유 광섬유 정을 사용 하 여 신생아 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 제공 하는에서 유래 했거나 콜론 통해 통과할 photoconverted 조 혈 모 세포는 비장에서 찾을 수 있습니다 설명 합니다.
Protocol
모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다. 주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다. 1. 디자인 및 레이저 라이트-발광 ?…
Representative Results
광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀?…
Discussion
상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Altro | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Riferimenti
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
Citazione di questo articolo
Porter, C., Ennamorati, M., Jain, N. In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (138), e57929, doi:10.3791/57929 (2018).