En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales
Summary
El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.
Abstract
Comunidades bacterianas entéricas se establecen temprano en la vida e influyen en la función y desarrollo de las células inmunes. La microbiota neonatal es susceptible a numerosas influencias externas, incluyendo el uso de antibióticos y dieta, que afecta la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Trastornos como enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) se caracterizan por una afluencia masiva de las células inmunes a los intestinos. Sin embargo, las células inmunológicas condicionadas por la microbiota además pueden emigrar fuera de los intestinos para influir en las respuestas inmunitarias en sitios extraintestinales. Por lo tanto, es necesario identificar y caracterizar las células que lleven mensajes microbianos de los intestinos a sitios distales. Aquí, describimos un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos en vivo que permite su identificación en sitios extra intestinales después de la migración.
Introduction
El tracto gastrointestinal de mamífero alberga cientos de especies de bacterias que existen en una relación simbiótica con el huésped1. Las células inmunes presentes en el medio local hacer una convivencia con estos microbios y establecen una barrera protectora contra invasiones de patógeno. Así, las interacciones bidireccionales entre las células inmunes y la microbiota son críticas para establecer una comunidad de comensal que educa el sistema inmunológico del host y establece el umbral de reactividad inmune a los patógenos. Cambios en la microbiana composición, o disbiosis, pueden perturban la homeostasis inmune y perturban circuitos regulatorios que frenen inflamaciones intestinales llevando a enfermedades inmune-mediadas tales como Diabetes tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal2,3 .
El período inmediatamente después del nacimiento una única ventana del desarrollo durante el cual las comunidades microbianas intestinales comienzan a establecer al mismo tiempo el sistema inmune madura4. La microbiota postnatal no es estable, con cambios en la composición de la comunidad que ocurren naturalmente y con frecuencia5. Las células inmunes que interaccionan con la microbiota residen en dos localizaciones anatómicas distintas en el intestino – la lámina propia y el epitelio intestinal6. Numerosos tipos de células inmunes están presentes en el intestino, incluyendo los linfocitos (como células T, células B y células linfoides innatas) así como de las células mieloides (que incluyen macrófagos, monocitos y células dendríticas). Estas células, también conocido como células hematopoyéticas, realizan multitud de funciones que preservar la barrera intestinal y mantener la homeostasis.
Además de sus funciones de reguladoras en intestinal, las células inmunes de la mucosa también pueden llevar mensajes microbianos a los sitios extra intestinales regular inmunidad sistémica7,8,9. Esto es un área de creciente interés en la investigación y pone de relieve la necesidad de métodos identificar las células inmunes que migran fuera del tejido intestinal con el fin de sondear su función. El protocolo reportado aquí utiliza un modelo de ratón disponibles en el mercado donde una proteína fluorescente photoconvertible se explota a las células de etiqueta. Ubicuo, PhAMsuprimido ratones expresan una proteína verde fluorescente Dendra2 que esté irreversiblemente fluorescencia roja después de la activación por luz de ultravioleta (UV)10. Utilizando una cánula de fibra óptica para proporcionar luz de 405 nanómetro en el colon de ratones recién nacidos, demostramos que las células hematopoyéticas photoconverted, que originó adentro o tránsito por el colon pueden encontrarse en el bazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La identificación y caracterización de células que interactúan con y son influenciados por la microbiota del colon son importantes y deben facilitar la comprensión de cómo información del microambiente de la mucosa se transmitió al resto del cuerpo. Un método para estudiar la migración de células de intestino requiere el aislamiento de las células asociadas con tripa, seguida de una transferencia adoptiva en ratones receptores para determinar sus patrones de tejido-autoguiado hacia el blanco y función<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain fue apoyada por un premio de transición de carrera de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Altro | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Riferimenti
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