Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore
Summary
Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l’esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.
Abstract
Controllo delle crisi epilettiche rimane un problema difficile per la comunità medica. Per compiere progressi, i ricercatori hanno bisogno di un modo ampiamente studiare la dinamica di sequestro e indagare i meccanismi sottostanti. Modelli di sequestro acuta sono convenienti, offrono la possibilità di eseguire registrazioni elettrofisiologiche e possono generare un grande volume di elettrografici grippaggio-come (ictal) eventi. I promettenti risultati da modelli di sequestro acuta possono essere avanzati quindi ai modelli di epilessia cronica e studi clinici. Così, studiando i sequestri in modelli acuti che replicano fedelmente le firme elettrografiche e dinamiche di un grippaggio clinico sarà essenziale per rendere i risultati clinicamente rilevanti. Studiare gli eventi ictal in sequestro acuta modelli preparati dal tessuto umano è anche importante per rendere i risultati che sono clinicamente rilevanti. L’obiettivo fondamentale in questa carta è sul modello 4-AP corticale grazie alla sua versatilità nel generare eventi ictal negli studi sia in vivo che in vitro , così come nel tessuto umano sia il mouse. I metodi in questa carta saranno anche descrivere un metodo alternativo di induzione di sequestro utilizzando il modello Zero-Mg2 + e fornire una panoramica dettagliata dei vantaggi e limiti dell’attività epileptiform-come generati nelle diverse acuta modelli di sequestro. Inoltre, approfittando di optogenetica disponibile in commercio diversi ceppi di topi, un impulso di luce breve (30 ms) utilizzabile per attivare un evento ictal identico a quelle che si verificano spontaneamente. Allo stesso modo, soffi di 30-100 ms di neurotrasmettitori (acido Gamma-Amino butirrico o glutammato) possono essere applicati al tessuto umano per attivare eventi ictal che sono identici a quelli che si verificano spontaneamente. La capacità di innescare eventi ictal su richiesta in modelli acuti sequestro offre la ritrovata capacità di osservare l’esatta sequenza degli eventi che sono alla base della dinamica di iniziazione di sequestro e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.
Introduction
Modelli di sequestro acuta è in grado di riprodurre con successo elettrografiche firme ricorda eventi ictal osservati nell’elettroencefalogramma (EEG) di individui che avvertono un attacco epilettico. I ricercatori usano questi eventi ictal-come (di seguito definiti ‘ictal eventi’) come surrogati per il grippaggio evento1. Clinicamente, eventi ictal servono come un proxy affidabile per gli eventi di sequestro, poiché i sequestri sono un disturbo neurologico che proviene dal cervello. In unità di monitoraggio di epilessia, neurologi si basano sulla rilevazione di eventi ictal per confermare regione epilettogena del cervello e isolarlo per resezione2. In unità di cure intensive, i medici controllano attività ictal per valutare se qualsiasi attività convulsiva persiste in pazienti sedati3. Controllo delle crisi epilettiche rimane per essere un problema impegnativo per la comunità medica, come 30% dei pazienti di epilessia sono farmaco resistenti al farmaco disponibile4,5, e 10% di casi medici che coinvolgono i sequestri di droga-indotto sono non risponde al trattamento standard3. Questo presenta una seria preoccupazione per la società, come 10% della popolazione americana è prospezione per sperimentare un sequestro evento nella loro vita e 3% sono tenuti a sviluppare l’epilessia6.
Studiando i sequestri in modelli di epilessia cronica è costoso, faticoso e spesso impiegano mesi per preparare7. È anche difficile effettuare registrazioni elettrofisiologiche in animali liberi di muoversi. Test clinici umani affrontano problemi simili, come pure ulteriori complessità relative al consenso del paziente, variabilità in ambiti di provenienza dei partecipanti e le considerazioni etiche e morali coinvolti8. Modelli di crisi acuta, d’altra parte, sono favorevole perché sono relativamente conveniente da preparare, costo-efficiente e in grado di generare grandi volumi di eventi ictal per Studio9. Inoltre, il tessuto è fissato in una posizione stabile, quindi le condizioni sono ideali per eseguire le registrazioni elettrofisiologiche necessarie studiare dinamiche di grippaggio e la patofisiologia di fondo correlata. Modelli di acuta crisi restano favorevoli rispetto ai modelli in silico (computer) perché sono basati su materiale biologico composto costituente rete neuronale del cervello con tutti i suoi fattori e connettività sinaptica, che non può essere catturata 10i modelli di computer anche le più dettagliate. Queste caratteristiche rendono modelli acuta sequestro pronte ad per essere efficienti a screening per potenziali terapie anti-sequestro e rendendo i risultati preliminari prima di loro avanzare per ulteriori indagini nei modelli di epilessia cronica e studi clinici.
In genere, modelli di sequestro acuta sono derivati dal tessuto normale del cervello che è stato sottoposto a condizioni di iper-eccitabile. Per indurre gli eventi ictal clinicamente rilevanti nel tessuto cerebrale sano, è importante capire che il cervello funziona in modo ottimale in un stato critico11 dove eccitazione (E) e l’inibizione (I) sono equilibrato12. Una perturbazione del E-ho equilibrio può portare allo stato iper-eccitabile sequestro in cui precipitano eventi ictal. Di conseguenza, all’interno di questo quadro concettuale, esistono due strategie principali per generare eventi ictal nelle fette del cervello (in vitro) o nelle preparazioni del intero-cervello (in vivo): sia diminuita inibizione (“disinibizione”) o aumentata eccitazione (“non-disinibizione”). Tuttavia, eventi ictal sono altamente ordinati e sincronizzati gli eventi che richiedono l’influenza di interneuroni GABAergici di orchestrare la rete neurale attività13,14. Per questo motivo, non-disinibizione modelli sono i più efficaci per la generazione di eventi ictal isolato di reti neurali, come in un in vitro cervello affettare15, considerando che in vitro disinibizione modelli comunemente conducono a chiodare l’attività ricorda di interictal-come chiodare. Inoltre, all’interno di questo quadro concettuale, un evento di sincronizzazione momentaneo anche in modo affidabile può innescare un evento ictal16. Infatti, può essere attivato un evento ictal mediante qualsiasi perturbazione minori applicato al sistema neurale17 quando è a un punto di transizione (“biforcazione”) stato critico18. Tradizionalmente, queste perturbazioni sono state indotte da stimolazione elettrica. Lo sviluppo recente di optogenetica in neuroscienza, tuttavia, offre ora una strategia più elegante per indurre lo stato critico transizioni16.
I metodi descritti in questo documento viene illustrato come generare eventi ictal su richiesta nei modelli di sequestro acuta sia in vitro (passaggio 1 del protocollo) e in vivo studi (punto 2 del protocollo). Essi comportano la scelta della regione del cervello, metodo di induzione del sequestro, studio tipo e specie; Tuttavia, il focus sarà sulla scelta consigliata di un modello acuto 4-AP corticale sequestro a causa della sua versatilità in un’ampia varietà di tipi di studio. Il modello di 4-AP sequestro acuta in vitro è basato sul protocollo standard per preparare fettine di cervello di alta qualità per registrazioni elettrofisiologiche e formazione immagine studia19. Questi protocolli sono già stati utilizzati per rendere in vitro fette coronali del cervello dalla corteccia somatosensory-motor di topi16,20 e gli esseri umani21. Modifiche per generare eventi ictal in questi tipi di fette del cervello sono state dimostrate in precedenza16 e tutti i dettagli sono descritti nel protocollo sotto. Il modello di 4-AP sequestro corticale acuta in vivo è basato sul protocollo standard per preparare un craniotomy per imaging studies22. La modifica è che nessuna finestra (vetrino) è installata dopo il craniotomy. Invece, agenti proconvulsivante (4-AP) vengono applicati per via topica alla corteccia esposta per indurre eventi ictal mentre l’animale è in anestesia generale. A nostra conoscenza, il nostro gruppo è stato il primo a sviluppare questo modello di grippaggio corticale acuta in vivo in topi16,23. Acuta in vivo 4-AP corticale sequestro modello preparato da topi adulti è stato sviluppato per completare il modello in vitro fetta dal tessuto giovanile. La replica dei risultati del modello di grippaggio adulto in vivo consente di generalizzare i risultati dai modelli di fetta di affrontare le preoccupazioni inerenti per quanto riguarda le condizioni di non-fisiologica di una fetta di cervello 2D (contro un 3-d del intero-cervello struttura) e le differenze fisiologiche tra tessuto giovanile e adulto.
Il metodo di apertura su richiesta evento ictal è dimostrato usando entrambi sbuffi di neurotrasmettitori con un picospritzer o optogenetica strategie. Al meglio della nostra conoscenza, il nostro gruppo è il primo ad avviare eventi ictal nel tessuto umano usando neurotrasmettitori tramite un picospritzer16. Per le strategie di optogenetica, il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo convenzionale utilizzato per esprimere i transgeni. L’espressione di channelrhodopsin-2 (ChR2) in interneuroni GABAergici o cellule piramidali glutamatergic fornirà la possibilità opzionale di generare eventi ictal on-demand con brevi impulsi di luce. Ceppi di topi optogenetica adatto comprendono la variante C57BL/6 disponibile in commercio che esprime la ChR2 in entrambi interneuroni, utilizzando il mouse vescicolare GABA trasportatore promotor (VGAT)24, o cellule piramidali, utilizzando l’antigene delle cellule di timo del mouse 1 Promotor (Thy1)25. Questi topi VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 disponibili in commercio offrono la possibilità di attivare i neuroni GABAergici o neuroni glutamatergici, rispettivamente, nella neocorteccia con blu (470 nm) luce. La capacità di generare gli eventi ictal on demand in modelli di sequestro acuta può offrire nuove opportunità per studiare la dinamica l’inizio di grippaggio e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fette di cervello sono trattate con un farmaco proconvulsivante o un’alterata perfusato ACSF aumentare eccitabilità della rete neurale e promuovere una precipitazione degli eventi ictal (elettrografici grippaggio-come eventi). Per i topi, le fette della corona preferite dell’area somatosensoriale-motore dovrebbero contenere la corteccia del cingulate, zona 2 (CG), ma non l’area di retrosplenial (RS); Questi marcatori anatomici consentono di identificare la gamma delle fette della corona che sono i migliori per l’indu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da istituti canadesi di ricerca sanitaria (MOP 119603 a Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), l’Istituto del cervello di Ontario (a Taufik A. Valiante) e il Mightex Student Research Grant (contro Michael Chang). Vorremmo ringraziare Liam Long per la sua assistenza nella contaminazione il manoscritto dei video. Vorremmo riconoscere Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda per la loro assistenza nella compilazione le figure e le tabelle in questo manoscritto. Figure 1A, 3A, 4Ae 6A sono tutte le figure originali realizzate dai dati pubblicati in Chang et al. 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
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