Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

Summary

Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Abstract

Controlar las convulsiones, sigue siendo un tema difícil para la comunidad médica. Para avanzar, los investigadores necesitan una forma de estudiar dinámica del asimiento e investigar sus mecanismos subyacentes. Convulsión aguda modelos son convenientes, ofrecen la posibilidad de realizar grabaciones electrofisiológicas y pueden generar un gran volumen de electrográficas asimiento-como acontecimientos (ictal). Los resultados prometedores de los modelos de la convulsión aguda luego pueden avanzar a modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos. Así, estudiando convulsiones en aguda modelos que reproducen fielmente las firmas electrográficas y dinámicas de un ataque clínico será esencial para hacer los resultados clínicamente relevantes. Estudiar acontecimientos ictales en convulsión aguda modelos preparados a partir de tejido humano también es importante para hacer conclusiones que son clínicamente relevantes. El objetivo primordial en este trabajo es en el modelo cortical de la 4-AP debido a su versatilidad en la generación de acontecimientos ictales en estudios tanto en vivo como en vitro , así como en ratón y tejido humano. Los métodos en este artículo también describe un método alternativo de la inducción de convulsiones mediante el modelo de cero Mg^{2 +} y proporcionar una descripción detallada de las ventajas y limitaciones de la actividad epileptiforme generada en las distintas aguda modelos de convulsiones. Por otra parte, aprovechando comercialmente disponible optogenetic cepas de ratón, un pulso de luz breve (30 ms) puede utilizarse para activar un evento ictal idéntico a las que ocurren espontáneamente. Asimismo, ms de 30-100 bocanadas de neurotransmisores (Ácido Gamma Amino butírico o glutamato) pueden aplicarse a tejido humano para desencadenar eventos ictales que son idénticos a las que ocurren espontáneamente. La capacidad de desencadenar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas ofrece la recién descubierta capacidad de observar la secuencia exacta de eventos que subyacen la dinámica de la iniciación de asimiento y evaluar eficientemente potenciales terapias anticonvulsivas.

Introduction

Modelos de crisis aguda pueden reproducir con éxito firmas electrográficas ictales eventos observados en el electroencefalograma (EEG) de las personas que experimentan una convulsión recuerdas. Los investigadores utilizan estos acontecimientos ictal como (en adelante ‘ictales eventos’) como sustitutos para el evento de decomiso¹. Clínico, ictales eventos sirven como un proxy confiable para los eventos de crisis puesto que las convulsiones son un trastorno neurológico que se origina en el cerebro. En la unidad de monitoreo de epilepsia, neurólogos se basan en la detección de eventos ictales para confirmar la región epileptógena del cerebro y aislarlo para resección². En la unidad de cuidados intensivos, los médicos monitorear actividad ictal evaluar si persiste cualquier actividad convulsiva en pacientes sedados³. Controlar las convulsiones queda un tema desafiante para la comunidad médica, como 30% de pacientes con epilepsia son resistentes a los fármaco a la medicación disponible^4,5, y 10% de casos médicos de convulsiones inducidas por drogas no responde al tratamiento estándar³. Esto presenta una seria preocupación para la sociedad, como 10% de la población estadounidense es prospectado para experimentar un episodio de convulsión en su vida y se espera que el 3% desarrollan epilepsia⁶.

Estudiando las convulsiones en modelos de epilepsia crónica es caro, laborioso y a menudo toma meses para preparar⁷. También es difícil realizar las grabaciones electrofisiológicas en animales en libre movimiento. Ensayos clínicos en humanos enfrentan a problemas similares, así como complicaciones adicionales relacionadas con el consentimiento del paciente, variabilidad de orígenes de los participantes y las consideraciones Morales y éticas involucradas⁸. Modelos de crisis aguda, por el contrario, son favorables porque son relativamente cómoda para prepararse, rentable y capaz de generar grandes volúmenes de eventos ictales de estudio⁹. Además, el tejido se fija en una posición estable, por lo que las condiciones son ideales para realizar las grabaciones electrofisiológicas necesarias para estudiar la dinámica de la crisis y la patofisiología subyacente relacionada. Modelos de convulsión aguda siguen siendo favorables sobre modelos en silico (PC) porque se basan en material biológico compuesto por constituyentes red neuronal del cerebro con todos sus factores inherentes y conectividad sináptica, que no puede ser capturado por la computadora más detallada de los modelos¹⁰. Estas características hacen de modelos de convulsión aguda preparados para ser eficiente en la detección de potenciales terapias anticonvulsivas y que resultados preliminares antes de avanzar para la posterior investigación en modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos.

Por lo general, modelos de convulsión aguda se derivan el tejido normal del cerebro que ha sido sometido a condiciones hiper excitable. Para inducir acontecimientos ictales clínicamente relevantes en el tejido cerebral sano, es importante entender que el cerebro funcione óptimamente en un estado crítico¹¹ donde (E) de la excitación y la inhibición (I) son equilibrados¹². Una interrupción de la E-I equilibrio puede llevar al estado de crisis hiper excitable que precipitan acontecimientos ictales. Por consiguiente, dentro de este marco conceptual, existen dos estrategias principales para generar eventos de ictales en rebanadas de cerebro (en vitro) o en preparaciones de todo el cerebro (en vivo): aumento o disminución de la inhibición (“desinhibición”) excitación (“no-desinhibición”). Sin embargo, acontecimientos ictales son altamente ordenados y sincronización eventos que requieren de la influencia de interneuronas GABAérgicas para organizar la red de los nervios actividad^13,14. Por esta razón, modelos de desinhibición no son los más efectivos para generar acontecimientos ictales en redes neuronales aisladas, como en una en vitro cerebro rebana¹⁵, mientras que en vitro modelos desinhibición comúnmente clavar actividad recuerda a clavar interictal-como. Además, dentro de este marco conceptual, un evento momentáneo de sincronización también fiable puede desencadenar un evento ictal¹⁶. De hecho, un evento ictal puede ser desencadenado por cualquier perturbación menor aplicada a los sistemas neuronales¹⁷ cuando se encuentra en un estado crítico de punto de transición (“bifurcación”)¹⁸. Tradicionalmente, estas perturbaciones fueron inducidas por estimulación eléctrica. Sin embargo, el reciente desarrollo de optogenetics en neurociencia, ofrece ahora una estrategia más elegante para inducir transiciones de estado crítico¹⁶.

Los métodos descritos en este artículo muestran cómo generar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas en vitro (paso 1 del Protocolo) y estudios en vivo (paso 2 del Protocolo). Implican la elección de la región del cerebro, método de inducción de convulsiones, tipo de estudio y especies; sin embargo, nos centraremos en la opción recomendada de un modelo agudo 4-AP corticales convulsiones debido a su versatilidad en una amplia variedad de tipos de estudios. El modelo de 4 AP convulsiones agudas en vitro se basa en el protocolo estándar para preparar rodajas de cerebro de alta calidad para grabaciones electrofisiológicas y la proyección de imagen estudia¹⁹. Estos protocolos ya han sido utilizados para hacer en vitro cerebro coronales rebanadas de la corteza somáticosensorial-motor de ratones^16,20 y seres humanos²¹. Modificaciones para generar acontecimientos ictales en estos tipos de rebanadas del cerebro han demostrado previamente¹⁶ y todos los detalles se describen en el Protocolo a continuación. El modelo agudo en vivo 4-AP convulsiones corticales se basa en el protocolo estándar para preparar una craneotomía para la proyección de imagen estudios²². La modificación es que no hay ventana (portaobjeto) está instalada después de la craneotomía. En cambio, agentes proconvulsant (4-AP) se aplican tópicamente a la corteza expuesta para inducir acontecimientos ictales mientras el animal está bajo anestesia general. A nuestro conocimiento, nuestro grupo fue el primero en desarrollar este modelo de crisis cortical aguda en vivo en ratones^16,23. El modelo de crisis cortical 4-AP aguda en vivo preparado a partir de ratones adultos fue desarrollado para complementar el modelo de corte en vitro del tejido juvenil. La replicación de los resultados en el modelo adulto en vivo ataque ayuda a generalizar los resultados de los modelos de la rebanada por atender las preocupaciones inherentes en cuanto a las condiciones no fisiológicas de un trozo de cerebro 2D (frente a un 3-d todo el cerebro estructura) y las diferencias fisiológicas entre juvenil y adulta del tejido.

El método de iniciación de evento ictal en la demanda se demuestra utilizando cualquiera de los dos soplos de neurotransmisores con estrategias de picospritzer o optogenetic. A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro grupo es el primero en iniciar acontecimientos ictales en tejido humano mediante neurotransmisores a través de un picospritzer¹⁶. Estrategias de optogenetic, la cepa de ratones C57BL/6 es la tensión convencional utilizada para la expresión de los transgenes. La expresión de channelrhodopsin-2 (ChR2) en interneuronas GABAérgicas o las células piramidales glutamatérgica proporcionará la capacidad opcional para generar acontecimientos ictal en demanda con pulsos breves de luz. Cepas de ratones de optogenetic conveniente incluyen la variante disponible en el mercado de C57BL/6 que expresa ChR2 en o interneuronas, utilizando el ratón vesicular GABA transporter promotor (VGAT)²⁴, o las células piramidales, usando el antígeno de la célula de ratón timo 1 promotor (Thy1)²⁵. Estos ratones VGAT ChR2 y Thy1-ChR2 comercialmente disponibles ofrecen la oportunidad de activar las neuronas GABAérgicas o neuronas glutamatérgica, respectivamente, en el neocortex con azul (470 nm) luz. La capacidad de generar eventos ictales en demanda en modelos de convulsiones agudas puede ofrecer oportunidades novela estudio convulsión iniciación dinámica y eficientemente evaluar potenciales terapias anticonvulsivas.

Protocol

Todas las investigaciones con pacientes fue realizada bajo un protocolo aprobado por el Consejo Universitario salud red investigación ética conforme a la declaración de Helsinki. Procedimientos que involucran animales estaban de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense en el cuidado Animal y aprobaron por el Krembil Instituto Animal cuidado Comité de investigación. 1. el Protocolo I: aguda In vitro asimiento modelo Preparación de soluciones de disecci…

Representative Results

La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de cerebro cortical μm tamaño 450 (intacto) buena calidad de un juvenil VGAT ChR2 ratón inducido confiablemente ictal eventos recurrentes (> 5 s) dentro de 15 min (figura 1Ai). La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de mala calidad producido explosión eventos o clavar actividad (figura 1Aii). En promedio, 40% de las láminas de cada cerebro de ratón disecado había generado con …

Discussion

Las rebanadas del cerebro se tratan con un medicamento proconvulsant o una solución ACSF alterado para aumentar la excitabilidad de la red neuronal y promover una precipitación de acontecimientos ictales (electrográficas asimiento-como acontecimientos). Para los ratones, deben contener las rebanadas coronales preferidas del área somatosensorial-motor de la corteza del cíngulo, área 2 (CG), pero no el área de retrosplenial (RS); Estos marcadores anatómicos ayudan a identificar la gama de rebanadas coronales que so…

Materials

Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store