Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Summary

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Abstract

Controlar convulsões permanece uma questão desafiadora para a comunidade médica. Para progredir, pesquisadores precisam de uma maneira extensivamente estudar a dinâmica de apreensão e investigar seus mecanismos subjacentes. Modelos de convulsão aguda são convenientes, oferecem a capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas e podem gerar um grande volume de electrographic apreensão, como de eventos (estável). Os resultados promissores de modelos de convulsão aguda então podem ser avançados para modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Assim, estudar convulsões em modelos agudas que reproduzem fielmente as assinaturas electrographic e dinâmicas de uma convulsão clínica será essencial para fazer achados clinicamente relevantes. Estudar eventos estável em convulsão aguda modelos preparados a partir de tecido humano também é importante para fazer descobertas que são clinicamente relevantes. O foco principal deste artigo é sobre o modelo 4-AP cortical devido a sua versatilidade em gerar eventos estável em estudos tanto in vivo e in vitro , bem como em rato e tecido humano. Os métodos neste artigo também irão descrever um método alternativo de indução de convulsões, usando o modelo^{2 +} Zero-Mg e fornecer uma visão geral detalhada das vantagens e limitações da atividade epileptiforme semelhantes gerados em diferentes aguda modelos de apreensão. Além disso, aproveitando comercialmente disponível optogenetic cepas de rato, um pulso de luz breve (30 ms) pode ser usado para acionar um evento estável idêntico àqueles que ocorrem espontaneamente. Da mesma forma, 30-100 ms sopros de neurotransmissores (ácido gama-Amino butírico ou glutamato) podem ser aplicados para o tecido humano para acionar eventos estável que são idênticos aos que ocorrem espontaneamente. A capacidade de desencadear eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda oferece a recém-descoberta capacidade de observar a sequência exata dos eventos que dão suporte à dinâmica de iniciação de apreensão e com eficiência, avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

Introduction

Modelos de convulsão aguda com êxito podem reproduzir electrographic assinaturas reminiscentes de eventos estável observados no eletroencefalograma (EEG) de indivíduos tendo uma convulsão. Os pesquisadores utilizam esses eventos como estável (aqui referidos como ‘eventos estável’) como substitutos para a apreensão de evento¹. Clinicamente, estável eventos servem como um proxy confiável para eventos de apreensão desde convulsões são um transtorno neurológico que se origina no cérebro. Na unidade de monitorização de epilepsia, neurologistas dependem a detecção de eventos estável para confirmar eletrofisiolà região do cérebro e isolá-lo para ressecção². Em unidade de terapia intensiva, os médicos monitoram atividade estável para avaliar se alguma atividade de apreensão persiste em pacientes sedado³. Controlar convulsões continua a ser uma questão desafiadora para a comunidade médica, como 30% dos pacientes de epilepsia são resistentes aos medicamentos, a medicação disponível^4,5, e 10% dos casos médicos envolvendo convulsões induzidas por drogas são Não responde ao tratamento padrão³. Isto apresenta uma preocupação séria para a sociedade, como 10% da população americana é prospectado para experimentar um evento de apreensão em sua vida e 3% são esperados para desenvolver epilepsia⁶.

Estudando as apreensões em modelos de epilepsia crônica é caro, trabalhoso e muitas vezes levar meses para preparar a⁷. É também difícil de executar gravações eletrofisiológicas em animais movimentando-se livremente. Ensaios clínicos humanos enfrentam problemas semelhantes, bem como as complexidades adicionais relacionadas com o consentimento do paciente, variabilidade nas origens dos participantes e as considerações morais e éticas envolvidas⁸. Modelos de convulsão aguda, por outro lado, são favoráveis, porque eles são relativamente conveniente para preparar, custo-eficiente e capaz de gerar grandes volumes de eventos estável para estudo⁹. Além disso, o tecido é fixo em uma posição estável, assim que as condições são ideais para a realização das gravações eletrofisiológicas necessárias para estudar a dinâmica de apreensão e a fisiopatologia subjacente relacionada. Modelos de convulsão aguda permanecem favoráveis sobre modelos em silico (computador), porque eles são baseados no material biológico composto de rede neuronal constituintes do cérebro com todos os seus factores inerentes e conectividade sináptica, que não pode ser capturada por computador até os mais detalhado modelos¹⁰. Estas características fazem modelos de convulsão aguda preparados para ser eficiente na triagem para potenciais anti-apreensão terapias e fazer conclusões preliminares antes de avançá-los para maiores investigações em modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos.

Normalmente, modelos de convulsão aguda são derivados do tecido cerebral normal que tenha sido submetido a condições hiperexcitável. Para induzir eventos estável clinicamente relevantes no tecido cerebral saudável, é importante compreender que o cérebro funciona otimamente em um estado crítico¹¹ onde (E) de excitação e inibição (I) são equilibradas¹². Uma interrupção do E-eu balanço pode levar ao estado de hiperexcitável apreensão em que precipitam eventos estável. Da mesma forma, dentro deste quadro conceptual, há duas estratégias principais para gerar eventos estável em fatias de cérebro (em vitro) ou em preparações todo-cérebro (na vivo): diminuição da inibição (“desinibição”) ou aumentada excitação (“não-desinibição”). No entanto, eventos estável são altamente ordenados e sincronizado eventos que exigem a influência dos interneurônios gabaérgica para orquestrar a rede neural atividade^13,14. Por esta razão, não-desinibição modelos são os mais eficazes para gerar eventos estável em redes neurais isolados, como em um em vitro cérebro fatia¹⁵, Considerando que em vitro modelos desinibição comumente levam a picos de atividade reminiscência de interictais como cravação. Além disso, dentro deste quadro conceptual, um evento de sincronização momentâneo confiável também pode desencadear um evento estável¹⁶. Na verdade, um evento estável pode ser desencadeado por qualquer pequena perturbação aplicada ao sistema neural¹⁷ quando está em um estado crítico de transição (“bifurcação”) ponto¹⁸. Tradicionalmente, estas perturbações foram induzidas por estimulação elétrica. No entanto, o recente desenvolvimento de optogenetics em neurociência, oferece agora uma estratégia mais elegante para induzir transições de estado crítico¹⁶.

Os métodos descritos neste artigo demonstram como gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda para tanto in vitro (etapa 1 do protocolo) e na vivo estudos (etapa 2 do protocolo). Eles envolvem a escolha da região do cérebro, método de indução de convulsões, tipo de estudo e espécie; no entanto, o foco será sobre a escolha recomendada de um modelo de apreensão de cortical aguda 4-AP devido à sua versatilidade em uma grande variedade de tipos de estudo. O modelo 4-AP convulsão aguda em vitro é baseado no protocolo padrão para preparar fatias de cérebro de alta qualidade para gravações eletrofisiológicas e¹⁹estudos de imagiologia. Esses protocolos já tem sido usados para fazer em vitro coronal do cérebro fatias de córtex somatossensorial-motor de ratos^16,20 e humanos²¹. Modificações para gerar eventos estável nestes tipos de fatias do cérebro tenham sido demonstradas anteriormente¹⁶ e os detalhes são descritos no protocolo abaixo. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo é baseado no protocolo padrão para preparar uma craniotomia para estudos²²de imagem. A modificação é que nenhuma janela (lâmina de vidro) é instalada após a craniotomia. Em vez disso, agentes proconvulsant (4-AP) são topicamente aplicados ao córtex exposto para induzir eventos estável, enquanto o animal está sob anestesia geral. A nosso conhecimento, nosso grupo foi o primeiro a desenvolver este modelo de apreensão cortical aguda na vivo em camundongos^16,23. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo preparado a partir de ratos adultos foi desenvolvido para complementar o modelo in vitro fatia do tecido juvenil. A replicação das conclusões no modelo de apreensão adulto na vivo contribui para generalizar os resultados de modelos de fatia, abordando as preocupações inerentes sobre as condições de não-fisiológica de uma fatia do cérebro 2D (contra um 3D todo-cérebro estrutura) e as diferenças fisiológicas entre jovens e adulto de tecido.

O método de início de evento estável sob demanda é demonstrado usando ou sopros de neurotransmissores com uma estratégias de picospritzer ou optogenetic. O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a iniciar eventos estável em tecido humano usando neurotransmissores através de um picospritzer¹⁶. Estratégias de optogenetic, a cepa de camundongos C57BL/6 é a tensão convencional usada para expressar transgenes. A expressão de channelrhodopsin-2 (ChR2) em interneurônios gabaérgica ou células piramidais glutamatérgico irá fornecer a capacidade opcional para gerar eventos estável on-demand com breves pulsos de luz. Cepas de ratos optogenetic adequado incluem a variante C57BL/6 comercialmente disponível que expressa ChR2 em qualquer interneurônios, usando o rato vesicular GABA transportador promotor (VGAT)²⁴, ou células piramidais, usando o antígeno da pilha do mouse Timo 1 promotor (Thy1)²⁵. Estes ratos VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 comercialmente disponíveis oferecem a oportunidade de ativar os neurônios gabaérgica ou neurônios glutamatérgico, respectivamente, no neocórtex com azul (470 nm) luz. A capacidade de gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda pode oferecer novas oportunidades para estudar a dinâmica de iniciação de apreensão e eficientemente avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

Protocol

Toda pesquisa envolvendo pacientes foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Conselho de ética da Universidade saúde rede pesquisa em conformidade com a declaração de Helsinque. Procedimentos que envolvam animais estavam em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense no cuidado Animal e aprovaram pelo Krembil Research Institute Animal conta Comité. 1. protocolo i: aguda com base no modelo In vitro apreensão Preparação de soluções de dissecação…

Representative Results

A aplicação de 100 µM 4-AP para (sem danos) 450 fatias de cérebro cortical µm de tamanho boa qualidade de um juvenil VGAT-ChR2 rato induzido confiável estável eventos recorrentes (> 5 s) dentro de 15 min (Figura 1Ai). A aplicação de 100 µM 4-AP para fatias de má qualidade resultou na ruptura eventos ou spiking atividade (Figura 1Aii). Em média, 40% das fatias de cada cérebro de rato dissecado gerado com êxito evento…

Discussion

As fatias do cérebro são tratadas com uma droga proconvulsant ou um perfusato ACSF alterado para aumentar a excitabilidade da rede neural e promover uma precipitação de estável eventos (electrographic apreensão-como). Para os ratos, as fatias coronais preferenciais da área somatossensorial-motor devem conter o córtex cingulado, área 2 (CG), mas não a área de retrosplenial (RS); estes marcadores anatômicos ajudam a identificar a gama de fatias coronais que são melhores para induzir eventos estável. Uma modif…

Materials

Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store