Hornhindens epitel slid med okulær Burr som en Model for hornhinden sårheling
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at påføre en slid okulær overflade af musen og følge den sårheling proces derefter. Protokollen tager fordel af en okulær burr delvist fjerne overflade epitel af øjet i bedøvet mus.
Abstract
Murine hornhinden giver en fremragende model for at studere sårheling. Hornhinden er det yderste lag af øjet, og dermed er det første forsvar mod skade. Faktisk er den mest almindelige form for øjenskader fundet i klinikken en hornhinde slid. Her, udnytte vi en okulær burr for at fremkalde en slid resulterer i fjernelse af hornhindens epitel i vivo på bedøvede mus. Denne metode giver mulighed for målrettet og reproducerbare epitelial forstyrrelser, forlader andre områder intakt. Derudover vi beskrive visualisering af slidt epitel med fluorescein farvning og yde konkret rådgivning om, hvordan man visualisere slidt hornhinden. Vi Følg tidslinjen af sårheling 0, 18 og 72 h efter slid, indtil såret er igen epithelialized. Modellens epitelial slid af cornea skade er ideel til undersøgelser om epitelcelle spredning, migration og fornyet epithelialization af hornhinde lag. Men, denne metode er ikke optimal at studere stromale aktivering i løbet af sårheling, fordi okulær burr ikke trænge ind til de stromale cellelag. Denne metode er også velegnet til kliniske applikationer, for eksempel, præ-klinisk test af narkotika effektivitet.
Introduction
Epitel lag af mange organer er udsat for skader. De indeholder imidlertid også mulighed for at kompensere for væv tab gennem sårheling. Hornhinden tilbyder en fremragende model for at studere sårheling. Det danner øjets ydre overflade og giver et beskyttende lag for den følsomme okulær maskiner. Hornhinden fungerer således, som en fysisk barriere for patogener og vandtab. Det består af tre lag. epitel, stroma og endotelet. Epitel af hornhinden udgør det yderste lag af hornhinden. Epitelceller opretholde den barriere funktion af hornhinden ved strengt at overholde hinanden gennem stramme kryds1,2,3. En acellulær hornhinde basalmembranen, den Bowman membran, adskiller epitel fra den omfattende stroma, som indeholder ildfaste keratocytes. Under stroma kanal endotelceller næringsstoffer, vand og ilt til det øverste lag.
Corneal hudafskrabninger er meget almindelige i klinikken4. Skader på hornhinden er mangfoldige, men er i høj grad forårsaget af små partikler såsom støv, sand, ridser eller andre fremmedlegemer. Protokollen beskrevet her sigter mod at gengive et klinisk relevante type af hornhindens epitel slid. Dermed giver denne protokol en kontrollerbar og skelsættende metode til klinikere og cornea forskere til at gennemføre deres egne undersøgelser. Vi har udført en i vivo skade reparation assay på murine hornhinden ved slibning væv med en sløvet okulær burr, Algerbrush II. Her, vi målrette slid kun til den centrale hornhindens epitel og lade de andre dele af orglet uden skader. Således protokollen er ideel til undersøgelse hornhinde epitelcelle dynamics eller basalmembranen under fornyet epithelialization, celle migration, spredning og differentiering i vivo5. For nylig blev denne model brugt til at analysere stamfader celle dynamics i murine hornhinden samt at afsløre kapacitet af de differentierede hornhinde epitelceller i genetablere hornhinde stamcelle niche efter skade6,7. Efter slid, hornhinden vender tilbage til sin normale gennemsigtighed og brudstyrke. Interessant, viste en in vitro- undersøgelse, at fornyet epithelialization sker uden øget celle spredning8. Denne protokol beskriver tidslinjen af uafbrudt healing i murine hornhinden. Metoden er således relevant at teste effekten af lægemidler på healing mønstre og hastighed.
Hornhinden har været flittigt brugt for sårheling undersøgelser. Dog har mange undersøgelser påberåbt sig andre modeller af skade. En veletableret model af cornea skade er basisk brænde, der er udført ved at anvende natriumhydroxid (NaOH) med eller uden filter papir på hornhindens overflade9. Alkalisk eksponering resulterer i et stort og diffus skade, der påvirker ikke blot hornhindens epitel, men også conjunctiva og stroma9,10. Stærkt alkalisk løsninger har vist sig at fremkalde hornhinde sår, mattering og neovascularization9. Inflammatoriske celler invadere stroma typisk inden for 6 h og forblive der indtil 24 h11. Alkalisk skade er således en tilrådeligt metode i undersøgelser vedrørende stromale aktivering. En anden type af kemiske skade kan være påført ved at anvende dimethylsulfoxid (DMSO) på hornhinden9,10. Andre almindeligt anvendte skade modeller omfatter incisional sår, der trænger igennem de stroma og keratectomy sår, som er begrænset til den øverste del af stroma14,15. Disse metoder er også nyttige til at besvare spørgsmål vedrørende stromale sårheling. Forskellige skade modeller har deres egne fordele og ulemper. Slid, eller debridering af hornhindens epitel blev først udviklet ved hjælp af sløvet skalpeller eller vinger på ex vivo hornhinder16. Denne metode har senere været brugt i vivo på mus, rotte og kanin17,18,19,20,21,22. Ved hjælp af okulær burr (figur 1), fjerner vi kun en valgte område af epitel, upåvirket resten af epitel. Denne måde, det er muligt at præcist målrettede epitelial fjernelse til forskellige dele af hornhinden. Derudover kan slid størrelse vurderes med fluorescein farvning. Desuden, her følger vi slid lukning den helbredende periode.
Denne metode indebærer flere fordele, i) herunder præcise placering af slid websted, som ikke er muligt med kemisk skade, ii) slid er hurtig til at udføre, og iii) det er non-invasiv. Heri, beskrive vi metoden ved hjælp af outbred NMRI musen som model, men dette kan anvendes til det enorme opbud af musen genetiske modeller samt til rotte og kanin, som er fælles modeller, der anvendes til at studere menneskets hornhinde forstyrrelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Såret metoder er populære værktøjer til at studere forskellige aspekter af cornea homøostase og patologier. Den slidstyrke model tilbyder en velkontrollerede metode for at tage fat på relevante problemer i oftalmologi. Visse kritiske punkter i protokollen er dog værd at understrege. Især detaljerne skitseret vedrørende veterinærmedicin, sår healing tidslinje og resultatet er optimeret til brug med outbred NMRI og ICR bestande, men kan variere blandt stammer af mus26. Med denne protokol,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Kaisa Ikkala for hendes uvurderlig faglig bistand og indsigtsfulde hjælp når aktualiserende denne metode og senere under gennemførelsen på vores centrale forskningsspørgsmål. Vi vil også gerne takke Laboratory Animal Center og Anna Meller for hendes hjælp med planlægning retningslinjer af den veterinærmedicinske arbejde.
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
