Роговицы эпителиальных истиранию с глазной заусенцев, как модель для роговицы заживление ран

Summary

Этот протокол описывает метод нанести истирания поверхности глаза мыши и следовать за процесс заживления ран после этого. Протокол использует глазной Берр частично удалить поверхности эпителия глаза анестезированные мышей.

Abstract

Мышиных роговицы обеспечивает отличную модель для изучения заживление ран. Роговицы верхний слой глаза и таким образом первой обороны, травмы. В самом деле наиболее распространенный тип травмы глаз, в клинике является роговицы ссадины. Здесь мы используем глазной Берр побудить износа, что приводит к удалению эпителия роговицы в естественных условиях на наркотизированных мышей. Этот метод позволяет для целевых и воспроизводимые эпителиальных потрясений, оставляя нетронутыми других областях. Кроме того мы описывают визуализации прошлифовать эпителия с окрашивание флюоресцеином и представить конкретные рекомендации о том, как визуализировать прошлифовать роговицы. Затем мы следуем сроки заживления 0, 18 и 72 ч после истирания, пока рана является повторное грануломах. Эпителиальный истиранию модель повреждение роговицы идеально подходит для исследования пролиферации эпителиальных клеток, миграции и эпителизация слоев роговицы. Однако этот метод не является оптимальным для изучения стромальные активации во время заживления ран, потому что глазной заусенцев не проникают в слои стромальных клеток. Этот метод также подходит для клинического применения, например, Доклинические испытания эффективности препарата.

Introduction

Эпителиального слоя многочисленных органов подвержены травм. Однако они также содержат способность компенсировать потери ткани через заживление ран. Роговицы предлагает отличную модель для изучения заживление ран. Он образует внешней поверхности глаза и обеспечивает защитный слой для чувствительных глазной техники. Таким образом роговица функционирует как физический барьер патогенов и потери воды. Он состоит из трех слоев; эпителий, строма и эндотелия. Эпителий роговицы делает верхний слой роговицы. Эпителиальные клетки поддерживают функцию барьера роговицы, строго придерживаясь друг друга через плотные соединения^1,2,3. Бесклеточной роговицы в базальной мембраны, Боумена, отделяет эпителия от обширной стромы, которая содержит тугоплавкие кератиноцитах. В строме эндотелиальные клетки канал питательных веществ, воды и кислорода в верхний слой.

Роговицы ссадины являются очень распространенными в клинике⁴. Травмы роговицы разнообразны, но во многом вызваны мелких частиц, таких как пыль или песок, царапин или других посторонних предметов. Протокол описано здесь направлена на воспроизведение клинически значимых тип эпителия роговицы ссадины. Поступая таким образом, этот протокол обеспечивает контролируемый и семенных метод для клиницистов и роговицы ученых для реализации своих собственных исследований. Мы выступали в vivo пробирного ремонт повреждений на мышиных роговицы абразивной ткани с притупилась глазной Берр, Algerbrush II. Здесь, мы нацелены на истирание только к центральной эпителия роговицы и оставить другие части органа без повреждений. Таким образом протокол является идеальным для изучения динамики роговицы эпителиальных клеток или базальной мембраны во время эпителизация, ячейка миграции, пролиферации и дифференцировки в vivo⁵. Недавно эта модель была использована для анализа прогениторных клеток динамика в мышиных роговицы, а также раскрыть потенциал дифференцированной роговицы эпителиальных клеток в восстановлении ниши стволовых клеток роговицы после травмы^6,7. После истирания роговицы возвращается в его нормальное прозрачности и прочности. Интересно, что в vitro исследование показало, что эпителизация происходит без увеличения клеток распространения⁸. Этот протокол описывает шкале времени непрерывного исцеления в мышиных роговицы. Таким образом, метод применим проверить влияние наркотиков на исцеление шаблоны и скорость.

Роговицы был широко используется для заживления ран исследований. Однако многие исследования опирались на других моделях травмы. Устоявшиеся модели повреждение роговицы является щелочной ожога, который производится путем применения гидроокиси натрия (NaOH) с или без фильтровальной бумаги на поверхности роговицы⁹. Щелочные воздействия результатов в больших и рассеянных травмы, которая затрагивает не только эпителия роговицы, но и конъюнктивы и стромы^9,10. Было показано, что сильное щелочных растворов вызывают язвы роговицы, помутнение и неоваскуляризации⁹. Воспалительные клетки вторгнуться стромы обычно в течение 6 ч и остаются там до 24 h¹¹. Таким образом щелочные травмы является целесообразным методом в исследованиях, связанных с стромальные активации. Другой тип химической травмы может быть нанесен, применяя диметилсульфоксида (ДМСО) на роговице^9,10. Другие часто используемые травмы модели включают инцизионная раны, которые проникают через стромы и кератэктомия раны, которые ограничены к верхней части стромы^14,15. Эти методы полезны также ответить на вопросы относительно стромальных заживление ран. Различные травмы модели имеют свои преимущества и недостатки. Ссадина или хирургическая, эпителия роговицы был впервые разработан с использованием притупилась скальпели или лопастей ex vivo роговицы¹⁶. Этот метод был позднее используется в естественных условиях на мыши, крысы и кролик^{17,18,19,20,21,22}. Используя глазной Бёрр (рис. 1), мы удаляем только выбранной области эпителия, затрагивая остальной эпителия. Таким образом, это возможно для более точного эпителиальных удаления в различные части роговицы. Кроме того можно оценить размер износа с окрашивание флюоресцеином. Кроме того здесь мы следуем истиранию закрытия во время периода заживления.

Этот метод создает ряд преимуществ, i) включая точное местоположение сайта истиранию, который не возможен с химической травмы, ii истирания быстро выполнять, и iii) это неинвазивные. Здесь мы описываем метод, с помощью беспородных ВММНИИ мыши как модель, однако это может применяться широкий спектр генетической модели мыши, а также крыс и кроликов, которые являются общей модели, используемые для изучения антропогенного роговицы.

Protocol

Все эксперименты утверждаются Советом Национального животных эксперимент. 1. Подготовка Подготовить все решения и держать при комнатной температуре, если не указано иное. Соблюдайте правила утилизации отходов dispose используемых материалов и решений. Использо?…

Representative Results

Этот протокол описывает модель причинять ущерб истиранию к мыши роговицы и предлагает как следовать и визуализировать процесс заживления после истирания. Недавно мы использовали этот метод для изучения роли эпителия роговицы прогениторных клеток во время заживлени…

Discussion

Ранение методы являются популярные инструменты для изучения различных аспектов роговицы гомеостаза и патологий. Истиранию модель предлагает хорошо контролируемых метод для решения соответствующих проблем в офтальмологии. Однако некоторые критические точки в протоколе, следует под?…

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA