Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Summary

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Abstract

A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.

Introduction

Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas^1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.

Abrasões da córnea são muito comuns na clínica⁴. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo⁵. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão^6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação⁸. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.

A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea⁹. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma^9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização⁹. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h¹¹. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea^9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma^14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas¹⁶. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho^{17,18,19,20,21,22}. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.

Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.

Protocol

Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal. 1. preparações Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções. Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa…

Representative Results

Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante6de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (<st…

Discussion

Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos<sup class="xre…

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA