Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

Summary

여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.

Abstract

마우스 모델의 사용은 다양 한 질병의 병 태 생리학 공부를 위한 불가결. 폐암에 관하여 몇 가지 모델을 사용할 수 있습니다, 그리고 유전자를 포함 하 여 설계 모델 뿐만 아니라 이식 모델. 그러나, 유전자 조작된 마우스 모델은 어렵고 비싼, 일부 orthotopic 이식 모델은 재현 하기 어려운 반면. 여기, 대체 orthotopic 이식 모델로 폐 종양 세포의 비-침략 적 intratracheal 전달 방법 설명 되어 있습니다. 마우스 폐 선 암 세포 및 syngeneic 이식 받는 사람을 사용 하 여 완전히 활성 면역 체계의 존재 아래 tumorigenesis 공부 수 있습니다. 또한, 종양의 유전자 조작 세포 이식 게 생리 적인 조건 하에서 프로이 모델 종양 성장과 종양 세포 유전자 발현에 유전 요인의 영향을 공부 하는 매력적인 시간 절약 접근 하기 전에. 우리는 폐 선 암 셀 표시이 모델을 사용 하 여 T 세포 억제기의 빠른 증가 수준 생체 외에서 재배에 비해 그들의 자연 환경에서 성장 하는 때 죽음-ligand 1 (PD-L1) 프로그램.

Introduction

폐암은 아직까지 남자와 여자 둘 다¹에서 가장 큰 암 관련 살인자 이다. 실제로, 미국 암 협회에 따르면 매년 유 방, 전립선, 결 장 암 함께¹보다 폐암의 다이 더 많은 사람들이. 최근까지, 비 작은 세포 폐암 (NSCLC)는 폐암의 가장 풍부한 하위에서에서 고통 받는 환자의 대부분 주로 신생의 추가 함께 첫 줄 속에서 백 금 기반의 화학 요법으로 치료 했다 억제제². 환자의 부분 집합 anaplastic 림프 종 키나 제 (ALK), 또는 ROS1, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 종양 돌연변이 비호 하 고 사용할 수 있는 대상 약^3,4대우 될 수 있다. 검사점 면역 억제제의 도래와 함께 폐 암 환자에 대 한 새로운 희망이 생겨났다, 비록 지금까지만 20-40%의 환자는 면역 치료⁵에 응답. 따라서, 추가 연구 필요 면역 검사점 치료를 미세 조정 하 고 조합 치료 옵션을 조사 하 여이 결과 개선 합니다.

폐암 연구, 전 임상 모델의 광대 한 배열을 사용할 수 있습니다, 그리고 자발적인 모델 등 모델 (GEMM) 학위 종양의 조건부 활성화 다음 발생 화학 물질과 발암 물질과 유전자 조작된 마우스에 의해 실행 oncogenes 또는 종양 억제기 유전자^6,,78의 비활성화. 이 모델은 폐 종양 개발의 기본 프로세스를 조사 하기 위해 특정 값의 하지만 그들은 또한 광범위 한 쥐 사육, 요구 그리고 실험은 시간이 걸리는. 따라서, 많은 연구 잠재적인 억제제 평가 활용 피하 (환자-파생)이 종이 식 모델 immunodeficient 마우스⁹에 인간의 폐 암 세포 라인은 피하 주입.

이 모델에서 종양의 micromilieu 표시 되지 않습니다 따라; 따라서, 연구원은 또한 orthotopic 이식 모델 사용, 어디 종양 세포는 주입 정 맥, intrabronchially, 또는 직접 폐 실질^{10,,1112,13, 14,15,16,17,18,,1920}. 이러한 메서드 중 일부는 기술적으로 도전적인, 재현할 수 및 연구자의 집중적인 훈련을 필요로입니다. ²¹ 여기 우리는 비-침략 적 orthotopic immunocompetent 쥐, 종양 3-5 주 이내 개발과 인간의 종양, T-세포의 표현을 유도 하에 상당한 유사성을 전시에 intratracheal 이식 방법 적응 억압 죽음-ligand 1 (PD-L1) 종양 세포에 프로그램. ^{11 , 12 ,} GEMM 모델에서 파생 된 ²⁰ 마우스 종양 세포를 사용 하며 syngeneic 받는 사람 마우스 면역 세포를 포함 하 여 종양 microenvironment의 적절 한 공부 또한, CRISPR/Cas9 기술²² 같은 도구를 편집 하는 유전자 생체 이식 폐 tumorigenesis에서 유전적 요인의 영향의 조사를 용이 하 게 하기 전에 사용할 수 있습니다.

Protocol

모든 실험 프로토콜 개요로 아래 윤리 지침 그리고 과학의 오스트리아 연방 정부, 연구 및 경제에 의해 승인 했다. 참고: 여기에 프로토콜 syngeneic 받는 사람으로 orthotopic 이식 모델을 마우스 폐 선 암 셀을 설명합니다. 셀 KraLSL-G12D의 종양-베어링 폐에서 격리 될 수 있습니다: p53fl/플로리다 (KP) 마우스7,18,…

Representative Results

우리는 종양 microenvironment 자극 PD L1 식 여부를 테스트 하려면 intratracheal 종양 세포 배달을 통해 orthotopic 이식 모델을 사용. 따라서, 우리는 학위 KP 모델 (KP 셀)에서 마우스 폐 AC 셀 Cre recombinase 표현 하는 아 데 노 바이러스 (Ad.Cre) 배달24통해 종양 유도 따라 10 주를 고립. 그 후, 우리는 폐 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하 여 AC 셀 표시-intratracheal 배달을 ?…

Discussion

공부 하 고 폐에서 폐 생리 및 pathologic 행사, 다양 한 시 약의 문제에 대 한 침략과 비-침략 적 intratracheal 삽 관 법 메서드는 널리^{26,,2728,29 ,30,,3132}. 암 분야에서 연구자는 intratracheal 사용 (및 intranasal) 폐 상피 세포에 체세포 …

Materials

mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/ml Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/ml Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82