Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1
Summary
כאן נתאר מודל השתלת orthotopic syngeneic פולשנית של תאים אדנוקרצינומה של הריאה העכבר כמודל זמן – ו בהפחתת עלויות ללמוד סרטן ריאות שאינם קטנים התא.
Abstract
השימוש העכבר מודלים היא הכרחית עבור לימוד הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות. לגבי סרטן ריאות, במספר דגמים זמינים, כולל גנטית מהונדסים מודלים, כמו גם מודלים השתלת. עם זאת, מודלים מהונדס גנטית עכבר הם זמן רב ויקר, ואילו דגמים השתלת orthotopic קשים להתרבות. כאן, שיטת משלוח intratracheal לא פולשנית של תאים סרטניים ריאות כמודל השתלת orthotopic חלופי הוא תיאר. השימוש העכבר ריאות אדנוקרצינומה תאים והנמענים שתל syngeneic מאפשר ללמוד tumorigenesis תחת הנוכחות של מערכת החיסון פעיל מלא. יתר על כן, שינויים גנטיים של גידול תאים לפני השתלת גורם מודל זה גישה לחיסכון בזמן אטרקטיבי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים על הגידול ועל גידול התא גנים פרופילים בתנאים פיזיולוגיים. באמצעות מודל זה, אנו מציגים את הריאה תאים אדנוקרצינומה אקספרס רמות גבוהות של משתיק קול T-cell מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1) כאשר גדל בסביבה הטבעית שלהם לעומת טיפוח במבחנה.
Introduction
סרטן הריאות הוא עדיין עד כה הרוצח הגדול ביותר הקשורים לסרטן הן גברים והן נשים1. ואכן, על פי האגודה האמריקנית לסרטן, כל שנה יותר אנשים מתים מסרטן הריאות מאשר של השד, הערמונית, המעי הגס סרטן ביחד1 עד לאחרונה, רוב החולים הסובלים סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC), המהווה סוג המשנה הנפוץ ביותר של סרטן ריאות, טופלו עם פלטינה מבוססי כימותרפיה באווירה השורה הראשונה, בעיקר עם התוספת של אנגיוגנזה מעכבי2. רק תת-ערכה של חולים בנמלים מוטציות oncogenic הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), קינאז לימפומה אנפלסטית (ALK), או ROS1, ולא יכולים להיות מטופלים עם זמינות מיקוד סמים3,4. עם כניסתו של מעכבי המערכת החיסונית במחסום, שצמחו תקווה חדשה לחולי סרטן ריאות, אמנם עד עכשיו, רק 20-40% מהחולים מגיבים לטיפול מערכת החיסון5. לפיכך, בהמשך המחקר נדרש כדי לשפר את התוצאה על ידי כוונון מחסום המערכת החיסונית טיפול חוקרים את אפשרויות הטיפול combinatory.
ללמוד סרטן ריאות, מגוון רחב של מודלים פרה זמינים, כולל דגמים ספונטנית מופעלות על ידי כימיקלים, חומרים מסרטנים ועכבר מהונדס גנטית מודלים (GEMM) בו גידולים autochthonous להתעורר בעקבות הפעלת מותנה oncogenes ו/או איון של הגידול משתיק קול גנים6,7,8. מודלים אלה הם בעלי ערך מסוים כדי לחקור תהליכי יסוד בהתפתחות סרטן ריאות, אבל הם גם דורשים עכברים נרחב רבייה, ניסויים הם זמן רב. לכן, מחקרים רבים הערכת פוטנציאל מעכבי את היתרון של מודלים xenograft תת עורית (נגזר החולה) שבו שורות תאים של סרטן ריאות אדם subcutaneously מוזרק עכברים immunodeficient9.
דגמים אלה, micromilieu של גידולים אינו מיוצג בהתאם; לכן, החוקרים להשתמש גם מודלים השתלת orthotopic, שבו תאים סרטניים שהם מזריקים לווריד, intrabronchially או ישירות לתוך הריאות parenchyma10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. כמה שיטות אלה הן מבחינה טכנית מאתגר, קשה להיות מועתק, וזקוקים אימונים אינטנסיביים של החוקרים. 21 . שינינו orthotopic לא פולשנית, intratracheal שיטת השתלת בעכברים immunocompetent, איפה גידולים לפתח בתוך 3-5 שבועות, נספח למחזהו משמעותי גידולים אנושיים, לזירוז הביטוי של T-cell משתיק קול מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1) על תאים סרטניים. 11 , 12 , 20 השימוש של תאים סרטניים העכבר נגזר GEMM מודלים ומאפשר עכברים הנמען syngeneic לומד נכונה של microenvironment הגידול כולל תאים חיסוניים. יתר על כן, ג’ין עריכה כלים כמו CRISPR/Cas9 טכנולוגיה22 יכול לשמש במבחנה לפני השתלת המאפשרת החקירה של ההשפעה של גורמים גנטיים בתוך הריאות tumorigenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר ריאות הפיזיולוגיות ואירועים פיפטות בריאה, intratracheal פולשני ו פולשני שיטות צנרור החדרה של ריאגנטים שונים נמצאים בשימוש נרחב26,27,28,29 ,30,31,32. בתחום הסרטן, חוקרים …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות Safia Zahma עזרה עם הכנת הרקמה מקטעים.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Ricerca sul cancro. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
