Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1
Summary
Aqui descrevemos um modelo de transplante ortotópico syngeneic minimamente invasiva de células de adenocarcinoma do pulmão como um modelo de redução de custos e tempo para estudar o câncer de pulmão não-pequenas células.
Abstract
O uso de modelos de rato é indispensável para o estudo da fisiopatologia de diversas doenças. Em relação ao câncer de pulmão, vários modelos estão disponíveis, incluindo geneticamente projetado modelos, bem como modelos de transplante. No entanto, modelos de rato geneticamente modificados são demorado e caro, Considerando que alguns modelos de transplante ortotópico são difíceis de reproduzir. Aqui, um método de entrega intratraqueal invasivo de células tumorais de pulmão como um modelo de transplante ortotópico alternativo é descrito. O uso de células de adenocarcinoma do pulmão e enxerto syngeneic destinatários permite estudar tumorigênese sob a presença de um sistema imunológico totalmente ativo. Além disso, as manipulações genéticas de tumor células antes de transplante faz este modelo uma abordagem atraente de economia de tempo para estudar o impacto de fatores genéticos sobre o crescimento do tumor e expressão de gene de células de tumor perfis sob condições fisiológicas. Usando este modelo, mostramos esse pulmão células de adenocarcinoma expressos níveis aumentados do supressor células T programado morte-ligante 1 (PD-L1), quando cultivado em seu ambiente natural em comparação com o cultivo in vitro.
Introduction
Câncer de pulmão é, ainda de longe, o maior assassino relacionadas com cancro em homens e mulheres1. Com efeito, de acordo com a American Cancer Society, todos os anos mais as pessoas morrem de câncer de pulmão do que de mama, próstata e cólon câncer juntos1. Até recentemente, a maioria dos pacientes que sofrem de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC), que é o mais abundante do subtipo de câncer de pulmão, foram tratada com quimioterapia baseados em platina, em um cenário de primeira linha, principalmente com a adição da angiogênese inibidores de2. Apenas um subconjunto de pacientes abriga oncogênicas mutações no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), no linfoma anaplásico da quinase (ALK), ou em ROS1 e pode ser tratado com drogas alvo disponível3,4. Com o advento dos inibidores de ponto de verificação imune, nova esperança para pacientes de câncer de pulmão, surgiu, embora até agora, apenas 20 – 40% dos pacientes respondem à terapia imune5. Daí, mais pesquisa é necessária para melhorar este resultado, ajustando a terapia imune de ponto de verificação e investigar as opções de tratamento combinatória.
Para estudar o câncer de pulmão, uma vasta gama de modelos pré-clínicos estão disponível, incluindo modelos espontâneos provocada por produtos químicos e substâncias cancerígenas e rato geneticamente modelos (GEMM) onde autóctones tumores surgem após a ativação condicional de oncogenes e/ou a inactivação do tumor supressor genes6,7,8. Estes modelos são de particular valor para investigar processos fundamentais no desenvolvimento do tumor de pulmão, mas eles também exigem extensivos ratos reprodução e experimentos são demorados. Portanto, muitos estudos avaliando inibidores potenciais aproveitam modelos xenoenxertos (paciente-derivado) subcutâneo onde linhas de células de câncer de pulmão humano por via subcutânea são injetadas em camundongos imunodeficientes9.
Nestes modelos, o micromilieu de tumores não está representada em conformidade; daí, os pesquisadores também utilizam modelos de transplante ortotópico, onde as células do tumor são injetadas por via intravenosa, intrabronchially ou diretamente o pulmão parênquima10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Alguns desses métodos são tecnicamente desafiador, difícil de ser reproduzida e exigem treinamento intensivo dos pesquisadores. 21 aqui adaptamos um ortotópico não invasiva, método de transplante intratraqueal em camundongos imunocompetentes, onde tumores desenvolvem-se dentro de 3-5 semanas e apresentam semelhanças significativas com tumores humanos, para induzir a expressão da célula-T supressor de programado morte-ligante 1 (PD-L1) em células tumorais. 11 , 12 , 20 o uso de células de tumor do mouse derivada de modelos GEMM e syngeneic ratos destinatários permite estudar adequada do microambiente do tumor incluindo células do sistema imunológico. Além disso, gene edição ferramentas como CRISPR/Cas9 tecnologia22 pode ser utilizado in vitro antes do transplante, o que facilita a investigação do impacto dos fatores genéticos na tumorigênese do pulmão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para estudar eventos fisiológicos e patológicos de pulmão no pulmão, métodos de intubação intratraqueal invasiva e não-invasivo para a instilação de vários reagentes são amplamente utilizado26,,27,28,29 ,30,31,32. No campo do câncer, os pesquisadores utilizam o intratraqueal (e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a ajuda com a preparação de cortes de tecido Safia Zahma.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Ricerca sul cancro. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
