Trasplante ortotópico de células de Adenocarcinoma de pulmón Syngeneic para estudiar la expresión de PD-L1
Summary
Aquí describimos un modelo de trasplante orthotopic syngeneic mínimamente invasivo de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón como un modelo de reducción de costos y tiempo para el estudio de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Abstract
El uso de modelos de ratón es indispensable para el estudio de la fisiopatología de diversas enfermedades. Con respecto al cáncer de pulmón, varios modelos están disponibles, incluyendo genéticamente diseñado modelos como modelos de trasplante. Sin embargo, modelos de ratón modificados genéticamente son lentos y caros, mientras que algunos modelos de trasplante ortotópico son difíciles de reproducir. Aquí, se describe un método de entrega intratraqueal no invasivo de las células tumorales de pulmón como un modelo de trasplante orthotopic alternativos. El uso de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón y receptores de injerto syngeneic permite estudiar tumorigenesis bajo la presencia de un sistema inmune activo. Además, las manipulaciones genéticas del tumor células antes del trasplante hace este modelo un atractivo enfoque de ahorro de tiempo para estudiar el impacto de los factores genéticos en el crecimiento del tumor y la expresión de gene de la célula de tumor perfiles bajo condiciones fisiológicas. Usando este modelo, demostramos eso pulmón células de adenocarcinoma expresados niveles crecientes del supresor de T-cell programan ligando de muerte 1 (PD-L1) cuando cultivadas en su entorno natural en comparación con el cultivo in vitro.
Introduction
Cáncer de pulmón es todavía en gran medida el más grande asesino relacionado con el cáncer en hombres y mujeres1. De hecho, según la American Cancer Society, cada año más personas mueren de cáncer de pulmón que de mama, próstata y colon cáncer juntos1. Hasta hace poco, la mayoría de los pacientes que sufren de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que es el más abundante subtipo de cáncer de pulmón, fueron tratada con quimioterapia basada en platino en un entorno de primera línea, sobre todo con la adición de la angiogénesis inhibidores de la2. Sólo un subconjunto de pacientes alberga las mutaciones oncogénicas en el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), kinasa del linfoma anaplásico (ALK), o en ROS1 y puede tratarse con medicamentos dirigidos a disposición3,4. Con el advenimiento de los inhibidores de control inmune, ha surgido la nueva esperanza para pacientes con cáncer de pulmón, aunque hasta ahora, sólo un 20-40% de los pacientes responden a la terapia inmune5. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para mejorar este resultado por ajuste terapia inmune checkpoint e investigando opciones de tratamiento combinatorio.
Para estudiar el cáncer de pulmón, una gran variedad de modelos preclínicos están disponible, incluyendo modelos espontáneos provocados por productos químicos y agentes carcinógenos y ratón genéticamente modelos (GEMM) donde se presentan tumores autóctonos tras la activación condicional de oncogenes o la inactivación de tumor supresor genes6,7,8. Estos modelos son de particular valor para investigar los procesos fundamentales en el desarrollo del tumor de pulmón, pero también requieren extensa ratones de cría, y los experimentos son desperdiciadores de tiempo. Por lo tanto, muchos estudios evaluando potenciales inhibidores aprovechan modelos de xenoinjerto subcutáneo (paciente de origen) en líneas celulares de cáncer humano de pulmón se inyectan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes9.
En estos modelos, la micromilieu de tumores no está representado en consecuencia; por lo tanto, los investigadores también utilizan modelos de trasplante orthotopic, donde las células del tumor se inyectan por vía intravenosa, intrabronchially o directamente en el pulmón parénquima10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Algunos de estos métodos son un desafío técnico, difícil de reproducir y requieren una capacitación intensiva de los investigadores. 21 aquí adaptamos un orthotopic invasiva, método de trasplante intratraqueal en ratones inmunocompetentes, donde los tumores desarrollan dentro de 3-5 semanas y exhiben semejanzas significativas en los tumores humanos, inducir la expresión de la célula de T supresor programados ligando de muerte 1 (PD-L1) en las células del tumor. 11 , 12 , 20 el uso de las células tumorales de ratón derivadas de modelos GEMM y ratones receptores syngeneic permite el estudio adecuado del microambiente tumoral incluyendo las células inmunes. Además, gen herramientas como CRISPR/Cas9 tecnología22 de edición puede ser utilizado in vitro antes de un trasplante que facilita la investigación del impacto de factores genéticos en la tumorogénesis pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para estudiar eventos fisiológicos y patológicos del pulmón en el pulmón, métodos de intubación endotraqueal invasiva y no invasiva para la instilación de diversos reactivos son ampliamente utilizado26,27,28,29 ,30,31,32. En el campo del cáncer, los investigadores utilizan la intrat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Safia Zahma por su ayuda con la preparación de las secciones de tejido.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
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