Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1
Summary
Qui descriviamo un modello di trapianto orthotopic syngeneic minimamente invasiva delle cellule di adenocarcinoma del polmone del topo come un modello di tempo – e riduzione dei costi per studiare il cancro del polmone non a piccole cellule.
Abstract
L’utilizzo di modelli murini è indispensabile per lo studio della fisiopatologia delle malattie varie. Per quanto riguarda il cancro del polmone, sono disponibili diversi modelli, tra cui geneticamente ingegnerizzati modelli così come i modelli di trapianto. Tuttavia, modelli murini geneticamente sono lunghe e costose, considerando che alcuni modelli di trapianto orthotopic sono difficili da riprodurre. Qui, un metodo di consegna intratracheale non invasiva delle cellule del tumore del polmone come un modello di trapianto ortotopico alternativo è descritto. L’uso di cellule di adenocarcinoma del polmone del topo e destinatari di trapianto syngeneic permette di studiare il tumorigenesis in presenza di un sistema immunitario pienamente attiva. Inoltre, le manipolazioni genetiche del tumore le cellule prima di trapianto rende questo modello un approccio attraente di risparmiare tempo per studiare l’impatto dei fattori genetici sulla crescita del tumore e l’espressione genica delle cellule di tumore profili in condizioni fisiologiche. Utilizzando questo modello, vi mostriamo quello polmone cellule dell’adenocarcinoma espresso livelli aumentati del soppressore T-cellula programmata morte-legante 1 (PD-L1) quando coltivate nel loro ambiente naturale rispetto alla coltivazione in vitro.
Introduction
Cancro ai polmoni è ancora di gran lunga il più grande assassino di neoplasia in uomini e donne1. Infatti, secondo l’American Cancer Society, ogni anno più persone muoiono di cancro al polmone rispetto al seno, prostata e colon cancro insieme1. Fino a poco tempo, la maggior parte dei pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), che è il sottotipo più abbondante del cancro del polmone, sono stata curata con la chemioterapia platino-basata in un ambiente di prima linea, per lo più con l’aggiunta dell’angiogenesi inibitori2. Solo un sottoinsieme dei pazienti porti mutazioni oncogeniche nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), chinasi anaplastic di linfoma (ALK) o in ROS1 e può essere trattato con farmaci targeting disponibili:3,4. Con l’avvento degli inibitori di checkpoint immuni, nuova speranza per i malati di cancro del polmone è sorto, anche se fino ad ora, solo il 20-40% dei pazienti risponde alla terapia immune5. Quindi, ulteriore ricerca è necessaria per migliorare questo risultato di fine-tuning terapia immunitaria checkpoint e indagando le opzioni di trattamento combinatorio.
Per studiare il cancro del polmone, una vasta gamma di modelli preclinici sono disponibile, compresi i modelli spontanee innescato da prodotti chimici e agenti cancerogeni e geneticamente costruito del topo modelli (GEMM) dove i tumori autoctoni derivano dopo l’attivazione condizionale del oncogeni e/o l’inattivazione di tumore soppressore geni6,7,8. Questi modelli sono di particolare valore per indagare i processi fondamentali nello sviluppo del tumore del polmone, ma richiedono anche topi vasti allevamento, e gli esperimenti sono che richiede tempo. Di conseguenza, molti studi che valutano potenziali inibitori sfruttare modelli sottocutaneo dello xenotrapianto (paziente-derivato) dove linee cellulari del cancro del polmone umano vengono iniettati per via sottocutanea in topi immunodeficienti9.
In questi modelli, la micromilieu dei tumori non è rappresentato in conseguenza; quindi, i ricercatori usano anche modelli di trapianto ortotopico, dove le cellule del tumore sono iniettate per via endovenosa, intrabronchially o direttamente nel polmone parenchima10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Alcuni di questi metodi sono tecnicamente impegnativi, difficili da essere riprodotto e richiedono una formazione intensiva dei ricercatori. 21 qui abbiamo adattato un invasivo ortotopico, intratracheale metodo di trapianto in topi immunocompetenti, dove i tumori si sviluppano entro 3-5 settimane ed esibiscono le somiglianze significative di tumori umani, di indurre l’espressione della T-cellula soppressore programmata morte-legante 1 (PD-L1) sulle cellule del tumore. 11 , 12 , 20 l’uso delle cellule del tumore del mouse derivati da modelli di GEMM e topi syngeneic destinatari permette di studiare corretta del microambiente tumorale tra cui cellule del sistema immunitario. Inoltre, gene editing strumenti come CRISPR/Cas9 tecnologia22 può essere impiegato in vitro prima del trapianto che facilita l’indagine dell’impatto dei fattori genetici in tumorigenesis del polmone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per studiare gli eventi fisiologici e patologici del polmone nel polmone, metodi di intubazione endotracheale invasive e non invasive per l’instillazione di vari reagenti sono ampiamente usato26,27,28,29 ,30,31,32. Nel campo del cancro, i ricercatori usano l’intratracheale (e intranasale) i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Safia Zahma per il suo aiuto con la preparazione delle sezioni del tessuto.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
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