Traitement ciblé et sélectif des tératomes de dérivé de cellules souches pluripotentes à l’aide de radiothérapie externe dans un modèle de petits animaux
Summary
Recherche sur les stratégies de traitement pour les tératomes de dérivés de cellules souches pluripotentes est importante pour la traduction clinique de la thérapie de cellules souches. Nous décrivons ici un protocole visant, en premier lieu, générer des cellules souches dérivées de tératomes chez la souris et, ensuite, à cible sélectivement et traiter ces tumeurs in vivo à l’aide d’un irradiateur de petits animaux.
Abstract
Le nombre croissant de victimes du « tourisme de cellules souches, » le non réglementée transplantation de cellules souches dans le monde entier, a soulevé des préoccupations concernant la sécurité des cellules souches hématopoïétiques. Bien que la transplantation de différencie plutôt que des cellules indifférenciées est une pratique courante, les tératomes peuvent encore résulter de la présence de résidus des cellules souches indifférenciées au moment de la transplantation ou de mutations spontanées dans différenciés cellules. Parce que les cellules souches sont souvent envoyées dans des sites sensibles anatomiquement, même les petites tumeurs peuvent être cliniquement dévastatrices, aboutissant à la cécité, la paralysie, les anomalies cognitives et trouble cardiovasculaire. Accès aux soins chirurgicaux à ces sites peut également être limitée, laissant les patients avec peu d’options thérapeutiques. Contrôler les débordements de cellules souches est donc critique pour la traduction clinique de la thérapie de cellules souches.
Radiothérapie externe offre un moyen efficace d’offrir la thérapie ciblée d’alléger le fardeau de tératome tout en minimisant les blessures qui entoure les organes. En outre, cette méthode évite la manipulation génétique ou transduction virale des cellules souches, qui sont associées à la sécurité clinique supplémentaire et de l’efficacité. Nous décrivons ici un protocole pour créer des tératomes de dérivés de cellules souches pluripotentes chez la souris et d’appliquer la radiothérapie externe pour sélectivement l’ablation de ces tumeurs in vivo.
Introduction
Le développement de thérapies de cellules souches pour la régénération tissulaire a rencontré un certain nombre d’obstacles dans les dernières décennies, qui entravent les efforts de déploiement clinique efficace. Ces obstacles comprennent rétention cellulaire pauvre sur les sites de livraison, cellules souches immunogénicité et néoplasiques susceptibles de tératomes de formule1. Tumorigénicité est particulièrement préoccupante clinique car il peut potentiellement nuire à stem cell transplantation destinataires2. Comptes de la formation de tumeurs en raison des injections non réglementée des cellules souches ont déjà été signalés dans plusieurs contextes cliniques3,4,5. Le risque de formation de tératome est le plus fréquemment cité préoccupation clinique dans le développement de cellules souches (CFP) pluripotentes et a entraîné des retards et des annulations de plusieurs prestigieux les cellules souches embryonnaires (CSE) et induite par les cellules souches pluripotentes (iPSC) les essais6,7,8,9. Ainsi, il y a un besoin pressant pour une enquête translationnelle dédiée à offrir un traitement approprié, ces tumeurs iatrogènes surviendrait.
A ce jour, plus des stratégies pour contrôler les débordements de cellules souches ont mis l’accent sur la réduction du nombre des cotes de sécurité avec tumorigènes potentiel2,10. Malheureusement, seul un petit nombre de cellules résiduelles (par exemple., 1 x 104 à 1 x 105 cellules11) est requis pour la formation de tératome, qui est bien en dessous du seuil de détection citée par les tests actuellement12, 13. autres restrictions de l’utilisation de ces méthodes de précollecte incluent faible efficacité et les frais élevés, le recours aux suspensions unicellulaires qui peuvent ne pas convenir pour nouvelles approches d’ingénierie tissulaire et l’altération potentielle de cellules survie et la prise de greffe.
Peu d’études ont abordé les options de traitement après formation de tératome. Peut-être la stratégie plus étudiée est l’incorporation de gènes « suicide » des cellules souches14,15. Cette méthode implique de manipuler génétiquement les cellules souches pour incorporer un gène inductible de-activation de l’apoptose pouvant être activés par post-injection de stimulation pharmacologique, offrant ainsi une approche de sauvetage si produisent des cellules injectées tératomes. Cette approche, a cependant, souffre d’importants inconvénients, y compris les effets des modifications génétiques du PSC et la possibilité d’un développement progressif de la résistance de drogue16hors cible. Une approche similaire utilise de petites molécules pour induire la mort cellulaire sélective des cotes de sécurité via l’inhibition de l’anti-apoptotique voies17. Autres groupes ont ciblé la mort cellulaire de PSC en utilisant des anticorps contre la pluripotence marqueurs de surface, tels que podocalyxin-like protein-1 (PODXL)18. Le moment de la livraison de petites molécules ou d’anticorps est d’avoir un impact significatif sur le potentiel thérapeutique des cotes de sécurité si livrés trop tôt et ne sont pas toujours l’efficacité thérapeutique si livré trop tard. En outre, les effets systémiques des petites molécules et des anticorps utilisés de cette manière n’ont pas été étudiées.
Une autre approche pour traiter ces tumeurs repose sur l’utilisation de radiothérapie externe (radiothérapie externe). Radiothérapie externe est l’une des modalités principales actuellement employées dans le traitement des tumeurs solides19. Innovations en radiothérapie externe, y compris l’élaboration du faisceau de protons et radiochirurgie stéréotaxique, ont permis le ciblage amélioré des structures pathologiques tout en évitant des dommages aux tissus normaux, rendant la radiothérapie externe conformationnelle idéal pour aborder le tératome formation dans les structures anatomiques sensibles20. En outre, cette méthode évite la manipulation génétique ou la transduction virale des cellules souches, qui sont à la fois lourde de sécurité clinique supplémentaires et l’efficacité porte sur15. Enfin, les progrès en micro-Irradiateurs ont permis l’application de la radiothérapie externe en rongeurs21.
Dans cet article, nous montrons comment créer un modèle de petits animaux de tératome formation en injectant CISP humaine chez la souris. Ensuite, nous montrons comment appliquer la radiothérapie externe pour éliminer sélectivement ces tumeurs in vivo avec un minimum de dommages aux tissus avoisinants. Cette approche fournit une thérapie ciblée pour dérivés CFP tératomes tout en évitant les effets hors-cible de la délivrance systémique des molécules biologiques et de peptides et de la manipulation génétique de la PSC. À des fins expérimentales, nous offrons une étape facultative pour transmettre des cellules de gènes rapporteurs pour suivre la réponse tumorale à la radiothérapie par bioluminescence imaging (BLI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Des données précliniques et des cas anecdotiques de victimes du « tourisme de cellules souches » confirment que le risque de développer des tératomes est un sérieux inconvénient associé à CFP traitements23. Développement d’approches prudents pour prévenir et traiter le risque néoplasique associé à des thérapies de cellules souches est donc une étape importante pour faciliter la traduction clinique des thérapies de régénération des cellules souches. Dans cet article, nous a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le National instituts de santé R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) et 5F32HL134221 (JWR) ; le Howard Hughes Medical Institute (ASL) ; et l’Institut cardiovasculaire de Stanford (ASL) pour leur soutien.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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