Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali
Summary
Ricerca sulle strategie di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti è importante per la traduzione clinica della terapia cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per, in primo luogo, generare teratomi derivati da cellule staminali in topi e, quindi, a selettivamente bersaglio e curare questi tumori in vivo usando un irradiatore di piccoli animali.
Abstract
Il crescente numero di vittime del “turismo delle cellule staminali,” il trapianto non regolamentato delle cellule staminali in tutto il mondo, ha sollevato preoccupazioni circa la sicurezza del trapianto di cellule staminali. Sebbene il trapianto di differenziato piuttosto che cellule indifferenziate è pratica comune, i teratomas possono ancora derivano dalla presenza di cellule staminali indifferenziate residuale al momento del trapianto o da mutazioni spontanee in differenziato cellule. Perché terapie con cellule staminali sono spesso trasportate in siti anatomicamente sensibili, anche i piccoli tumori possono essere clinicamente devastanti, con conseguente cecità, paralisi, cognitive anomalie e disfunzioni cardiovascolari. L’accesso chirurgico a questi siti potrebbe essere ridotte, lasciando i pazienti con poche opzioni terapeutiche. Controllo comportamento scorretto della cellula formativa è, quindi, critico per la traduzione clinica della terapia cellulare.
Radiazione esterna del fascio offre un mezzo efficace di erogare la terapia mirata a diminuire l’onere di teratoma, riducendo al minimo lesioni di organi circostanti. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale di cellule staminali, che sono associati con clinici supplementari di sicurezza ed efficacia. Qui, descriviamo un protocollo per creare i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti in topi e applicare la radioterapia esterna del fascio per ablazione selettivamente questi tumori in vivo.
Introduction
Lo sviluppo di terapie con cellule staminali per la rigenerazione tissutale ha rilevato un numero di barriere in parecchi decenni passati, che ostacola gli sforzi per la distribuzione efficiente di clinica. Questi ostacoli sono conservazione scadente delle cellule ai luoghi di consegna, l’immunogenicità delle cellule staminali e il potenziale neoplastico a forma i teratomas1. Carcinogenicità è di particolare interesse clinico in quanto può potenzialmente danneggiare cellule staminali trapianto destinatari2. Conti di formazione del tumore a causa di iniezioni di cellule staminali non regolamentata sono già stati segnalati in molteplici contesti clinici3,4,5. Il potenziale per la formazione di teratoma è il più frequentemente citati preoccupazione clinica nello sviluppo delle cellule staminali (PSC) pluripotenti e ha provocato ritardi e cancellazioni di più alto profilo sulle cellule staminali embrionali (ESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) prove6,7,8,9. Così, c’è una necessità urgente per una ricerca traslazionale dedicata verso fornendo trattamento appropriato, dovrebbero sorgere questi tumori iatrogenici.
Ad oggi, la maggior parte delle strategie per controllare il comportamento scorretto di cellule staminali si sono concentrati sulla riduzione del numero degli sportelli unici con potenziale cancerogeno2,10. Purtroppo, solo un piccolo numero di cellule residue (ad es.., 1 x 104 a 1 x 105 celle11) è necessario per la formazione di teratoma, che è molto di sotto del limite di rilevazione citata da saggi attualmente disponibili12, 13. altre limitazioni di utilizzo di questi metodi preseparazione includono bassa efficienza e costi elevati, dipendenza dalle sospensioni unicellulari che potrebbe non essere appropriato per più recenti approcci di ingegneria dei tessuti e il danno potenziale della cella sopravvivenza e l’attecchimento.
Pochi studi hanno affrontato le opzioni di trattamento seguendo la formazione di teratoma. Forse la strategia più ben studiata è l’incorporazione di geni di “suicidio” in cellule staminali14,15. Questo metodo consiste nel manipolare geneticamente le cellule staminali per incorporare un gene d’attivazione apoptosi inducibile che può essere attivato da postinjection di stimolazione farmacologica, fornendo così un approccio di salvataggio se iniettato le cellule producono i teratomas. Questo approccio, tuttavia, soffre di notevoli inconvenienti, tra cui gli effetti delle modificazioni genetiche di sportelli unici e il potenziale per uno sviluppo graduale di farmaco resistenza16fuori bersaglio. Un simile approccio utilizza piccole molecole per indurre la morte selettiva delle cellule degli sportelli unici via l’inibizione di anti-apoptotici vie17. Altri gruppi hanno preso di mira la morte delle cellule degli sportelli unici usando gli anticorpi contro marcatori di pluripotenza superficie, come Podocalixina-come proteina-1 (PODXL)18. I tempi di consegna della piccolo-molecola o anticorpo si trova ad avere un impatto significativo sul potenziale terapeutico degli sportelli unici, se consegnato troppo presto e può alcuna efficacia terapeutica, se consegnato troppo tardi. Inoltre, non sono stati studiati gli effetti sistemici di piccole molecole e gli anticorpi usati in questo modo.
Un approccio alternativo per il trattamento di questi tumori si basa sull’utilizzo di radioterapia esterna del fascio (EBRT). Radioterapia esterna è una delle modalità primaria attualmente impiegata nel trattamento di tumori solidi19. Innovazioni nella radioterapia esterna, compreso lo sviluppo del fascio di protoni e radiosurgery di stereotactic, hanno permesso l’ottimizzazione avanzata delle strutture patologiche, evitando danni al tessuto normale, rendendo conformal EBRT ideale per affrontare il teratoma formazione in strutture anatomicamente sensibili20. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale delle cellule staminali, che sono entrambi irto di ulteriore sicurezza clinica e l’efficacia riguarda15. Infine, gli avanzamenti in micro-irradiatori hanno permesso l’applicazione di EBRT in roditori21.
In questo articolo, dimostriamo come creare un modello di piccoli animali di formazione di teratoma iniettando iPSCs umane in topi. Abbiamo quindi illustrato come applicare EBRT per sradicare selettivamente questi tumori in vivo con minimo danno al tessuto circostante. Questo approccio fornisce una terapia mirata per i teratomas PSC-derivati, evitando gli effetti fuori bersaglio della consegna sistemica di molecole biologiche e peptidi e la manipolazione genetica degli sportelli unici. Ai fini d’investigazione, offriamo un passaggio facoltativo per trasdurre cellule staminali con geni reporter di monitorare la risposta del tumore alla radioterapia via bioluminescenza imaging (BLI).
Protocol
Representative Results
Discussion
I dati preclinici e casi aneddotici da vittime del “turismo delle cellule staminali” confermano che il rischio di sviluppare i teratomas è un grave inconveniente associato PSC trattamenti23. Sviluppo di approcci attenti per prevenire e trattare il rischio neoplastico associato a terapie con cellule staminali è, pertanto, un passo importante nel facilitare la traduzione clinica delle terapie rigenerative delle cellule staminali. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo di targeting terapeu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare la nazionale istituti di salute R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e l’Istituto cardiovascolare di Stanford (ASL) per il loro sostegno.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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