Целенаправленный и избирательный лечение плюрипотентных стволовых клеток тератомы, используя внешний пучка излучения в модели малого животных
Summary
Исследования по стратегиям тератомы плюрипотентных стволовых клеток лечение имеет важное значение для клинической перевод стволовых клеток. Здесь мы описываем протокол к, во-первых, генерировать стволовых клеток тератомы мышей и, затем, чтобы выборочно целевого и лечить эти опухоли в естественных условиях, с помощью малых животных облучателя.
Abstract
Растущее число жертв «туризма стволовых клеток, «нерегулируемого трансплантация стволовых клеток по всему миру, выразили обеспокоенность по поводу безопасности трансплантации стволовых клеток. Хотя пересадка продифференцированы вместо недифференцированных клеток является обычной практикой, тератомы могут по-прежнему возникают от присутствия остаточных недифференцированных стволовых клеток во время пересадки или от спонтанных мутаций в продифференцировано клетки. Потому что терапия стволовой клетки часто поставляются в анатомически спецобъектов, даже небольшие опухоли может быть клинически разрушительным, что приводит к слепоте, паралич, когнитивные нарушения и сердечно-сосудистой дисфункции. Хирургический доступ на эти сайты также могут быть ограничены, оставив больных с несколько терапевтические возможности. Контроль за недостойное поведение стволовых клеток, таким образом, решающее значение для клинической перевод стволовых клеток.
Внешний пучка излучения предлагает эффективным средством доставки таргетная терапия уменьшения бремени тератома при сведении к минимуму травмы в окружающие органы. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые связаны с дополнительных клинических безопасности и эффективности. Здесь мы описываем протокол для создания плюрипотентных стволовых клеток тератомы мышей и применять внешние пучка лучевой терапии, чтобы выборочно удалять эти опухоли в естественных условиях.
Introduction
Развитие терапии стволовой клетки для регенерации тканей столкнулся с рядом барьеров в последние несколько десятилетий, препятствуют усилиям по эффективной клинической развертывания. Эти препятствия включают бедных ячейки хранения на участках поставки, иммуногенность стволовых клеток и неопластические потенциал формы тератомы1. Tumorigenicity вызывает особое беспокойство клинических как он потенциально может нанести вред трансплантации стволовых клеток получателей2. Счетов образования опухоли из-за нерегулируемого стволовых клеток инъекции уже сообщалось в нескольких клинических параметров3,4,5. Потенциал для формирования тератома является наиболее часто цитируется клинических озабоченность в развитии плюрипотентных стволовых клеток (СМБ) и привела к задержки и отмены нескольких громких эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) испытания6,,78,9. Таким образом существует настоятельная необходимость для трансляционного расследования, выделенные на обеспечение надлежащего лечения, следует эти ятрогенные опухоли возникают.
На сегодняшний день, большинство стратегий для управления стволовых клеток проступок были направлены на сокращение числа ЦОНов с онкогенной потенциальных2,10. К сожалению только небольшое количество остаточного клеток (например,., 1 x 10-4 до 1 x 105 клеток11) необходим для формирования тератома, которая значительно ниже предела обнаружения котируется на имеющихся в настоящее время анализы12, 13. другие ограничения использования этих preseparation методы включают низкую эффективность и высокие расходы, зависимость от одноклеточного суспензий, которые не могут быть подходящими для новых подходов тканевой инженерии и потенциального обесценения ячейки выживание и приживления.
Несколько исследований были рассмотрены варианты лечения, после формирования тератома. Возможно наиболее изученной стратегии является включение «самоубийства» генов в стволовые клетки14,15. Этот метод предполагает, генетически манипулировать стволовых клеток для включения индуцибельной апоптоз активации генов, который может быть активирован фармакологических стимуляции postinjection, тем самым обеспечивая спасения подход, если вводили клетки производят тератомы. Этот подход, однако, страдает от существенных недостатков, включая эффекты пробить генетических модификаций ЦОНов и потенциал для постепенного развития наркотиков сопротивления16. Аналогичный подход использует малые молекулы побудить селективного клеточной гибели ЦОНов через ингибирование анти apoptotic пути17. Другие группы были направлены против смерти клетки ЦОНов с использованием антител против плюрипотентности поверхностных маркеров, такие как podocalyxin белка-1 (PODXL)18. Сроки доставки мелкомолекулярных или антитело стоит иметь значительное влияние на терапевтический потенциал Чок, если доставлено слишком рано и может отсутствовать терапевтической эффективности, если доставлен слишком поздно. Кроме того системные эффекты малых молекул и антитела, используемые в этой моде не были изучены.
Альтернативный подход к лечению этих опухолей опирается на использование внешний пучка излучения терапии (ДГТ). ДГТ является одним из основных механизмов, в настоящее время работают в лечении солидных опухолей19. Инновации в ДГТ, включая разработку наведение протонного луча и стереотаксической радиохирургии, позволили расширенной ориентации патологических структур избегая повреждения нормальной ткани, делая конформное ДГТ идеально подходит для решения тератома формирование в анатомически чувствительных структур20. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые оба сопряжено с дополнительных клинических безопасности и эффективности касается15. Наконец достижения в микро Облучатели позволили применение ДГТ в грызунов21.
В этой статье мы продемонстрируем создание малых животных модели формирования тератома путем инъекций человеческого iPSCs в мышах. Затем показано, как применять ДГТ выборочно искоренить эти опухоли в естественных условиях с минимальным ущербом для окружающих тканей. Этот подход обеспечивает таргетная терапия для СМБ производные тератомы избегая пробить последствий системных доставки биологических молекул и пептиды и генетические манипуляции Чок. Для исследуемого целей мы предлагаем необязательный шаг передавать стволовых клеток с генами репортер отслеживать через биолюминесценции изображений (BLI) опухоли ответ к лучевой терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Доклинические данные и анекдотические случаи от жертв «стволовых клеток туризма» подтверждают, что риск развития тератомы является серьезным недостатком, связанные с лечения PSC23. Таким образом, развитие внимательного подхода для предотвращения и лечения опухолевой риск,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить национальных институтов из здравоохранения R01 HL134830 (ПКН), K08 HL135343 (KS) и 5F32HL134221 (микропроцессорный); Говард Хьюз медицинский институт (ASL); и Институт сердечно-сосудистой Стэнфорд (ASL) за их поддержку.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
Riferimenti
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Ricerca sul cancro. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G. Dose-rate effects in targeted radiotherapy. Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).
