Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha
Summary
Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.
Abstract
A abelha é um organismo modelo para avaliação de comportamentos complexos e função cerebral, como aprendizagem, memória e divisão do trabalho. O corpo de cogumelo (MB) é um centro de cérebro superior proposto para ser o substrato neural dos comportamentos complexos da abelha. Embora estudos anteriores identificaram genes e proteínas diferencialmente expressas no MBs e outras regiões do cérebro, as atividades das proteínas em cada região não são ainda totalmente compreendidas. Para revelar as funções destas proteínas no cérebro, análise farmacológica é uma abordagem viável, mas é primeiro necessário para confirmar que manipulações farmacológicas de fato alteram a atividade de proteínas nestas regiões do cérebro.
Anteriormente, identificamos uma maior expressão dos genes que codificam a fosfolipase C (PLC) no MBs do que em outras regiões do cérebro e farmacologicamente avaliado o envolvimento do PLC no comportamento de abelhas. Nesse estudo, bioquimicamente testamos dois agentes farmacológicos e confirmou que eles diminuíram a atividade PLC no MBs e outras regiões do cérebro. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de como detectar atividade PLC na abelha cerebral homogeneizado. Neste sistema de ensaio, homogenates derivados de regiões diferentes do cérebro são reagiu com um substrato fluorogenic sintético, e fluorescência resultantes da actividade da PLC é quantificada e comparada entre regiões do cérebro. Também descrevemos a nossa avaliação dos efeitos inibitórios de certas drogas na atividade PLC, usando o mesmo sistema. Embora este sistema seja provável afetado por outros compostos endógenos fluorescência e/ou a absorção dos componentes do ensaio e tecidos, a medição da atividade PLC, usando este sistema é mais seguro e mais fácil do que usando o ensaio tradicional, que necessita de substratos radiolabeled. O procedimento simples e manipulações nos permitem examinar a atividade PLC no cérebro e outros tecidos das abelhas envolvidos nas diferentes tarefas sociais.
Introduction
A Europeu abelhas (Apis mellifera L.) é um inseto eusocial e abelhas femininas mostram reprodução da casta-dependente e dependente da idade de divisão do trabalho. Por exemplo, na casta estéril de abelhas, conhecido como “trabalhadores”, indivíduos mais jovens alimentam as ninhadas quando mais velhos forragem néctar e pólen fora da colmeia1. Aprendizagem e memória capacidade é criticamente importante na vida da abelha, porque operárias devem repetidamente ir e voltar entre fontes de alimento e seu ninho e então comunicar os locais das fontes de boa comida para seus nestmates através da dança comunicação1. Estudos anteriores demonstraram que o MB, um centro maior do cérebro em insetos, está envolvida na aprendizagem e memória capacidade da abelha2,3,4. Genes diferencialmente expressos e proteínas foram identificadas em várias regiões do cérebro das abelhas5,6,7,8,9,10 ,11, sugerindo que eles estão relacionados com as funções exclusivas de cada região do cérebro. Embora a inibição farmacológica ou ativação de uma proteína de interesse é uma abordagem bem utilizada para revelar a função da proteína no comportamento de abelhas a12,13,14, é desconhecido se todos drogas. têm efeitos funcionais em diferentes regiões do cérebro de abelhas. A validação das funções dessas drogas reforçará as conclusões em estudos de farmacologia comportamental.
Aqui, focalizamos PLC, uma das enzimas implicadas no rato cognição15,16,17,18. Cálcio de gatilhos PLC sinalização degradando o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre receptores IP3 , sobre o retículo endoplasmático (ER), levando à liberação de íons cálcio da emergência. O cálcio liberado ativa tanto cálcio-dependente/calmodulina proteína quinase II (CaMKII) com calmodulina e proteína quinase C (PKC) na presença de DAG. Ambos quinases de proteína estão envolvidos na aprendizagem e memória22,23, consistente com o envolvimento de PLC neste processo. CLPs são classificados em subtipos, incluindo PLCβ, PLCγ e PLCε, com base em suas estruturas de20. Cada subtipo PLC é ativado em um contexto diferente de20, e os genes que codificam os subtipos são diferencialmente expressos em diferentes tecidos. Demonstramos anteriormente que a abelha MBs expressam genes que codificam os subtipos PLCβ e PLCε em níveis mais elevados do que o restante de regiões cerebrais24, e que dois inibidores de pan-PLC (edelfosine e neomicina sulfato [neomicina]) diminuem a atividade PLC em diferentes regiões do cérebro e, de fato, afetar a capacidade de aprendizagem e memória do abelha24.
Tradicionalmente, a atividade enzimática da PLC foi medida usando radiolabeled PIP225, que requer instalações, equipamento e treinamento apropriado. Recentemente, um substrato fluorogenic sintético de PLC tem sido estabelecida26, tornando mais fácil para avaliar a atividade PLC em laboratório padrão. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para detectar atividade PLC em regiões cerebrais diferentes da abelha utilizando o substrato fluorogenic e posteriormente testar os efeitos inibitórios da edelfosine e neomicina no PLC nestes tecidos. Porque o protocolo exige apenas manipulações básicas, pode ser aplicável aos estudos da atividade PLC em outros tecidos ou áreas do cérebro em abelhas atribuídas tarefas sociais diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O exame bioquímico de atividade da proteína é profundamente importante para a compreensão molecular de sinalização no cérebro, porque a atividade de uma enzima é afectada por várias moléculas, tais como substratos e inibidores e pode, assim, mudar junto com comportamento animal (por exemplo, aprendizagem e memória)5. Em estudos de abelhas, enzimas como a adenilato ciclase, GMP cíclico-dependente da proteína quinase, PKC, CaMKII fosforilada e AMP cíclico-dependente da proteí…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figura 4B – 4D foi modificado de Suenami et al . 24 com a permissão do aberto de biologia. Os autores são gratos ao Publicador para a permissão. Este trabalho foi apoiado pela humana Frontier Science Program (RGY0077/2016) para Shota Suenami e Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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