Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja
Summary
Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.
Abstract
La abeja es un organismo modelo para la evaluación de conductas complejas y funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje, la memoria y la división del trabajo. El cuerpo de la seta (MB) es un centro mayor de cerebro propuesto para ser el sustrato neural de los comportamientos complejos de la abeja. Aunque estudios previos identificaron genes y proteínas que se expresan diferencialmente en los MBs y otras regiones cerebrales, las actividades de las proteínas en cada región no son entiende todavía completamente. Para descubrir las funciones de estas proteínas en el cerebro, análisis farmacológico es un método factible, pero es necesario para confirmar que las manipulaciones farmacológicas de hecho alteran la actividad de la proteína en estas regiones del cerebro.
Había identificado previamente una mayor expresión de genes que codifican la fosfolipasa C (PLC) en los MBs que en otras regiones del cerebro y evaluar farmacológicamente la participación del PLC en el comportamiento de las abejas. En ese estudio bioquímico había probado a dos agentes farmacológicos y confirmó que disminuyeron actividad PLC en el MBs y otras regiones del cerebro. Aquí, presentamos una descripción detallada de cómo detectar actividad PLC en homogeneizado de cerebro de la abeja. En este sistema de ensayo, homogenados derivados de regiones diferentes del cerebro se reaccionaron con un substrato sintético fluorógenos y fluorescencia resultantes de la actividad de la PLC es cuantificada y comparada entre regiones del cerebro. También Describimos nuestra evaluación de los efectos inhibitorios de ciertos fármacos sobre la actividad PLC utilizando el mismo sistema. Aunque este sistema probablemente afectados por otros compuestos endógenos de la fluorescencia o la absorbancia de los componentes del ensayo y los tejidos, la medición de la actividad de la PLC utilizando este sistema es más seguro y más fácil que eso usando el análisis tradicional, que requiere sustratos radiactivos. El procedimiento simple y manipulaciones nos permiten examinar la actividad PLC en el cerebro y otros tejidos de las abejas participan en diversas tareas sociales.
Introduction
La abeja europea (Apis mellifera L.) es un insecto eusocial, y las abejas hembra reproducción de castas dependientes y dependientes de la edad de división del trabajo. Por ejemplo, en la casta estéril de las abejas conocido como ‘trabajadores’, individuos más jóvenes alimentan las crías mientras que los más viejos de forraje néctar y polen fuera de la colmena1. Aprendizaje y la memoria de capacidad es de vital importancia en la vida de la abeja, porque forrajeros deben ir repetidamente hacia adelante y hacia atrás entre las fuentes de alimento y su nido y luego comunicar la ubicación de fuentes de comida a su similar a través del baile comunicación1. Estudios previos demostraron que los MB, un centro cerebral mayor en insectos, está implicado en la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja2,3,4. Genes diferencialmente expresados y las proteínas se han identificado en varias regiones del cerebro de la abeja5,6,7,8,9,10 ,11, sugiriendo que están relacionados con las funciones únicas de cada región del cerebro. Aunque la inhibición farmacológica o activación de una proteína de interés es un método usado para revelar la función de la proteína en el comportamiento de las abejas12,13,14, no se sabe si todos los medicamentos tener efectos funcionales en diferentes regiones del cerebro de la abeja. La validación de las funciones de tales drogas fortalecerá conclusiones en estudios de farmacología conductual.
Aquí, nos centramos en PLC, una de las enzimas implicadas en el ratón cognición15,16,17,18. PLC activa calcio por degradación de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre IP3 los receptores en el retículo endoplásmico (ER), conduce a la liberación de iones calcio de la ER. El calcio liberado activa dependiente de calcio/calmodulina quinasa II (CaMKII) calmodulina y proteína cinasa C (PKC) en presencia de DAG. Ambas proteínas quinasas están implicadas en el aprendizaje y la memoria22,23, coherente con la participación del PLC en este proceso. PLC ‘ s se dividen en subtipos, incluyendo PLCβ PLCγ y PLCε, basado en sus estructuras20. Cada subtipo PLC se activa en un contexto diferente de20, y los genes que codifican esos subtipos se expresan diferencialmente en diversos tejidos. Previamente demostramos que la abeja MBs expresarán genes que codifican los subtipos PLCβ y PLCε en niveles más altos que el resto de regiones cerebro24, y que dos inhibidores de la pan-PLC (edelfosine y neomicina sulfato [neomicina]) disminuyen la actividad PLC en diferentes regiones del cerebro y, de hecho, afectan la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja24.
Tradicionalmente, se ha medido la actividad enzimática de PLC utilizando radiactivos PIP225, que requiere instalaciones, equipos y formación adecuada. Recientemente, un substrato sintético fluorógenos de PLC ha sido establecido26, haciéndolo fácil evaluar actividad de la PLC en el laboratorio estándar. Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar actividad de PLC en regiones diferentes del cerebro de la abeja con el sustrato fluorógenos y posteriormente probar los efectos inhibitorios de edelfosine y neomicina en PLC en estos tejidos. Debido a que el protocolo requiere solamente manipulaciones básicas, pueden ser aplicable a los estudios de actividad de la PLC en otros tejidos o áreas del cerebro en las abejas asignadas a diversas tareas sociales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El examen bioquímico de la actividad de la proteína es profundamente importante para comprender la señalización molecular en el cerebro, porque la actividad de una enzima se ve afectada por varias moléculas, tales como sustratos e inhibidores y por lo tanto, puede cambiar a lo largo de con comportamiento animal (p. ej., aprendizaje y memoria)5. En los estudios de la abeja, enzimas tales como kinase de proteína dependiente de AMP cíclico A, proteína quinasa dependiente del GMP cíc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figura 4B – 4D fue modificado de los pantanos et al. 24 con el permiso de Biología abierta. Los autores agradecemos a la editorial por el permiso. Este trabajo fue apoyado por el programa humano de ciencia frontera (RGY0077/2016) Shota Suenami y Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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