Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene
Summary
Um die hemmende Wirkung von pharmakologische Agenten auf Phospholipase C (PLC) in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene zu testen, stellen wir einen biochemischen Assays um PLC-Aktivität in diesen Regionen zu messen. Dieser Test könnte nützlich für den Vergleich von PLC-Aktivität bei Geweben, sowie bei den Bienen, die unterschiedliche Verhalten ausstellen.
Abstract
Die Honigbiene ist ein Modellorganismus für die Bewertung von komplexen Verhaltensweisen und höheren Gehirnfunktion, wie lernen, Gedächtnis und Arbeitsteilung. Der Pilz Körper (MB) ist eine höhere hirnzentrums vorgeschlagen, das neuronale Substrat von komplexen Honigbiene Verhaltensweisen. Obwohl frühere Studien identifizierten Gene und Proteine, die in der MBs und anderen Gehirnregionen differentiell exprimiert werden, sind die Aktivitäten der Proteine in den einzelnen Regionen noch nicht vollständig verstanden. Um die Funktionen dieser Proteine im Gehirn sichtbar zu machen, ist pharmakologische Analyse einen machbaren Ansatz, aber es ist zunächst notwendig zu bestätigen, dass pharmakologische Manipulationen in der Tat die proteinaktivität in diesen Gehirnregionen verändern.
Wir zuvor identifizierten eine höhere Expression von Genen Codierung Phospholipase C (PLC) in der MBs als in anderen Gehirnregionen und pharmakologisch bewertet die Einbeziehung der PLC in Honigbiene Verhalten. In dieser Studie wir biochemisch zwei pharmakologische Wirkstoffe getestet und bestätigt, dass sie PLC-Aktivität in der MBs und anderen Gehirnregionen verringert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung wie man PLC Aktivität in Honigbiene Gehirn Homogenat erkennen. In diesem Testsystem Homogenates abgeleitet von verschiedenen Gehirnregionen sind mit einem synthetischen Fluorogenic Substrat reagiert und Fluoreszenz aus PLC Aktivität quantifiziert und im Vergleich zwischen Gehirnregionen. Wir beschreiben auch unsere Bewertung der hemmenden Wirkungen bestimmter Medikamente auf PLC-Aktivität mit dem gleichen System. Obwohl dieses System wahrscheinlich von anderen endogenen Fluoreszenz-Verbindungen bzw. die Absorption der Assay-Komponenten und Gewebe betroffen, die Messung von PLC-Aktivität, die mit diesem System ist sicherer und einfacher als, dass mit den traditionellen Assay, die radioaktiven Substrate erfordert. Die einfaches Verfahren und Manipulationen ermöglichen zu prüfen, PLC-Aktivität im Gehirn und anderen Geweben von Honigbienen in verschiedenen sozialen Aufgaben beteiligt.
Introduction
Die Europäische Honigbiene (Apis Mellifera L.) ist eine eusozialen Insekten, und weibliche Bienen zeigen Kaste-abhängige Reproduktion und altersabhängigen Arbeitsteilung. Zum Beispiel ernähren sich in der sterilen Kaste der Bienen als “Arbeitnehmer” bezeichnet, jüngere Personen Bruten während älteren Nektar und Pollen vor dem Bienenstock1Futter. Lernen und Gedächtnis, Fähigkeit von entscheidender Bedeutung im Leben der Honigbiene, weil Sammlerinnen müssen immer wieder hin und her zwischen Nahrungsquellen und ihr Nest gehen und dann die Standorte der gute Nahrungsquellen zu ihrer Nestmates durch den Tanz kommunizieren Kommunikation1. Frühere Studien zeigten, dass die lernen und Gedächtnis-Fähigkeit der Honigbiene2,3,4MB, eine höhere hirnzentrums bei Insekten, beteiligt ist. Differentiell exprimierten Gene und Proteine wurden in verschiedenen Gehirnregionen der Honigbiene5,6,7,8,9,10 ,11, was darauf hindeutet, dass sie die einzigartigen Funktionen von jeder Region des Gehirns verbunden sind. Obwohl die pharmakologische Hemmung oder Aktivierung eines Proteins des Interesses eine gut gebrauchte Ansatz zu zeigen, die Funktion des Proteins in der Honigbiene Verhalten12,13,14ist, ist es unbekannt, ob alle Medikamente haben Sie funktionelle Auswirkungen in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene. Die Validierung der Funktionen solcher Drogen stärkt Schlussfolgerungen in Studien des Verhaltens Pharmakologie.
Hier konzentrieren wir uns auf PLC, eines der Enzyme in Maus Kognition15,16,17,18verwickelt. PLC löst Kalzium Signalisierung durch Abbau von Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate (PIP2) in Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP3) und Diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP-3 öffnet IP-3 Rezeptoren auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER), führt zur Freisetzung von Calcium-Ionen aus der Notaufnahme. Das freigesetzte Kalzium aktiviert Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) mit Calmodulin und Proteinkinase C (PKC) in Anwesenheit von DAG. Beide Proteinkinasen sind lernen und Gedächtnis22,23, Einklang mit der Beteiligung der PLC an diesem Prozess beteiligt. SPS sind in Subtypen, einschließlich PLCβ, PLCγ und PLCε, basierend auf ihre Strukturen20kategorisiert. Jeder SPS-Subtyp wird in einem anderen Kontext20aktiviert, und Gene Kodierung dieser Subtypen sind differentiell in verschiedenen Geweben exprimiert. Wir zeigten zuvor, dass Honigbienen MBs Gene Kodierung PLCβ und PLCε Subtypen auf höheren Ebenen als die übrigen Gehirn Regionen24express und zwei Pan-PLC-Hemmer (Edelfosine und Neomycin Sulfat [Neomycin]) PLC Aktivität in verringern verschiedene Regionen des Gehirns und in der Tat, die lernen und Gedächtnis-Fähigkeit der Honigbiene24beeinflussen.
Traditionell wurde die enzymatische Aktivität der PLC mit radioaktiven PIP225, die entsprechende Ausbildung, Ausrüstung und Einrichtungen erfordert gemessen. Ein synthetisches Fluorogenic Substrat der PLC neuerdings etablierte26, macht es einfach, PLC-Aktivität in der standardlabor bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, PLC-Aktivität in verschiedenen Gehirnregionen der Honigbiene mit dem Fluorogenic Substrat zu erkennen und anschließend testen Sie die hemmende Wirkung von Edelfosine und Neomycin auf PLC in diesen Geweben. Da das Protokoll nur grundlegende Manipulationen erforderlich ist, kann es für Studien der PLC Tätigkeit in anderen Geweben oder Hirnareale bei Bienen, die verschiedene soziale Aufgaben zugeordnet sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die biochemische Untersuchung der proteinaktivität ist grundlegend wichtig für das Verständnis der molekularen Signale im Gehirn, weil die Aktivität eines Enzyms durch verschiedene Moleküle, wie Substrate und Inhibitoren, beeinflusst wird und kann somit zusammen mit das Verhalten der Tiere (z.B., lernen und Gedächtnis)5. In Honigbiene Studien sind Enzyme z. B. zyklische AMP-abhängige Proteinkinase A zyklisches GMP-abhängige Proteinkinase, PKC, phosphorylierten CaMKII und Adenylat-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Abbildung 4 b – 4D wurde von Suenami Et Al. modifiziert. 24 mit Genehmigung der Biologie geöffnet. Die Autoren sind dankbar an den Verlag für die Erlaubnis. Diese Arbeit wurde von der Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami und Ryo Miyazaki unterstützt.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Riferimenti
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
