Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Summary

É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.

Abstract

O enfisema é uma característica significativa da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os estudos que envolvem um modelo emphysematous do rato exigem a fixação óptima do pulmão para produzir espécimes histológicos de confiança do pulmão. Devido à natureza da composição estrutural do pulmão, que consiste em grande parte de ar e tecido, há um risco de que ela desmorona ou desestica durante o processo de fixação. Existem vários métodos de fixação pulmonar, cada um dos quais tem suas próprias vantagens e desvantagens. O método de fixação pulmonar aqui apresentado utiliza pressão constante para possibilitar a avaliação tecidual ideal para estudos utilizando um modelo de pulmão de camundongo emphysematoso. A principal vantagem é que ele pode corrigir muitos pulmões com a mesma condição de uma só vez. Os espécimes pulmonares são obtidos de camundongos crônicos expostos ao fumo do cigarro. A fixação pulmonar é realizada por meio de equipamentos especializados que possibilitam a produção de pressão constante. Esta pressão constante mantem o pulmão em um estado razoavelmente inflado. Assim, este método gera um espécime histológico do pulmão que é adequado para avaliar o enfisema leve induzido por fumaça de cigarro.

Introduction

A DPOC é uma das principais causas mundiais de óbito¹. A fumaça do cigarro é a causa mais importante da DPOC, mas os mecanismos de patogênese permanecem incompletamente definidos. A DPOC demonstra duas características principais, incluindo a limitação progressiva do fluxo aéreo e uma resposta inflamatória anormal do pulmão. A desordem emphysematous ocorre freqüentemente nos pulmões de pacientes de DPOC². Os achados patológicos do enfisema são caracterizados pela destruição da parede alveolar³. Várias espécies animais têm sido utilizadas para gerar modelos de DPOC in vivo (ou seja, cães, cobaias, macacos e roedores)⁴. No entanto, o mouse se tornou o mais comumente usado na construção de modelos de DPOC. Isso tem muitas vantagens, incluindo seu baixo custo, capacidade de ser geneticamente modificada, extensa disponibilidade de informação genômica, disponibilidade de anticorpos e capacidade de usar uma variedade de cepas de mouse⁵. Presentemente, não há nenhum modelo do rato que possa imitar as características cheias da DPOC humana; assim, os pesquisadores individuais devem escolher qual modelo é mais adequado para a pesquisa específica de DPOC⁶. O modelo do rato emphysematous é um de muitos modelos do rato de DPOC que estão atualmente disponíveis. Modelos adicionais incluem o modelo de exacerbação do camundongo, modelo de comorbidades sistêmicas e modelo de suscetibilidade à DPOC⁷.

O modelo emphysematous do rato pode ser gerado por diversos tipos de agentes exógenos, incluindo agentes químicos e exposição do fumo do cigarro⁴. A exposição química (por exemplo, a elastase) produz um tipo severo de enfisema, enquanto o fumo do cigarro resulta em enfisema leve^8,9. Acredita-se que a fumaça do cigarro seja a principal causa para a patogênese da DPOC; Portanto, a escolha da fumaça do cigarro como um meio para criar um modelo de mouse de DPOC é razoável¹⁰. Muitos estudos usaram fumaça de cigarro para criar enfisema no mouse. Por exemplo, Nikula et al. criaram com sucesso um modelo emphysematous do rato de B6C3F1 ratos fêmeas expondo os à fumaça de cigarro por 7 ou 13 meses¹¹. Nós igualmente estabelecemos um modelo emphysematous do rato através do marcador da senescência protein/SMP-30 ratos de KO¹². É crucial executar um método da fixação do pulmão que possa corretamente Visualizar este modelo suave do enfisema pela exposição do fumo do cigarro.

Vários métodos para fixação pulmonar foram estabelecidos¹³. No entanto, não há nenhum método padrão-ouro de fixação do tecido pulmonar para avaliação do enfisema¹⁴. Vários estudos deste laboratório mostraram que o sistema de fixação aqui apresentado é útil ao criar uma condição estável para avaliar o enfisema^{12,15,16,17,18.} A vantagem principal do sistema atual é que pode fixar muitos pulmões com a mesma circunstância em uma vez sem colapso ou deflação do pulmão. O sistema atual da fixação do pulmão usa algum equipamento especial que permita que os espécimes do pulmão sejam inflados em uma pressão constante apropriada por um período dado. Este equipamento especial consiste em três porções, incluindo um recipiente mais baixo, um recipiente superior, e uma bomba. Os espécimes pulmonares são colocados no recipiente inferior que está conectado a agentes de fixação pressurizados, resultando em uma diferença de pressão de 25 cmH₂o no nível de agentes entre os recipientes superior e inferior¹⁹.

Protocol

Os seguintes métodos foram aprovados pelos comitês de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade Juntendo. As directrizes para a conduta apropriada de experimentos animais, Conselho da ciência de Japão, junho 1, 2006 foram seguidas. Existem três etapas principais neste método: 1) dissecção do camundongo, 2) exsanguinação pulmonar e 3) fixação de tecidos pulmonares assistidos por equipamentos especializados. Tipicamente, os espécimes do pulmão são processados ao Embebimento após 48 …

Representative Results

Conforme descrito anteriormente, o equipamento especializado, que gera pressão constante estendida, pode ser dividido em três partes (Figura 3A). A parte inferior é o ponto no qual se insere a amostra pulmonar (Figura 4a). O pulmão é conectado através de uma cânula (20 G) à ponta do fluxo de formalina usando um galo de parada de três vias (Figura 4B). A pressão é gerada a…

Discussion

O procedimento de fixação para os pulmões de roedores aqui apresentados não é novidade; no entanto, este sistema tem várias vantagens. Em primeiro lugar, pode fixar muitos pulmões (máximo de 20) com a mesma condição de uma só vez. A sociedade de patologia toxicológica afirma que a pressão para a instilação da gravidade varia de 22 – 25 cmH₂O²². Notavelmente, vários estudos têm realizado fixação pulmonar a uma pressão de 25 cmH₂O¹³…

Materials

10% formalin (formalin neutral buffer solution)	Wako	060-01667
Bent forceps	Hammacher	HSC187-11
Cannula, size 20G	Terumo	SR-FS2032
Cannula, size 22G	Terumo	SR-OT2225C	Cannula to exsanguinate lung
Forceps	Hammacher	HSC184-10
Kimtowel	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	61000
Kimwipe	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	62011
Lower container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component
Roller pump	Nissin Scientific Corp	NRP-75	Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000	Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)	160200	Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mm	Sansyo	94-0479	Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)	Kyoritsu Seiyaku	SOM02-YA1312	Pentobarbital Sodium
Surgical scissor	Hammacher	HSB014-11
Suture thread, size 0	Nescosuture	GA01SW
Syringe, 1 mL	Terumo	SS-01T
Syringe, 1 ml with needle	Terumo	SS-01T2613S
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ESZ
Three-way stopcock	Terumo	TS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component