Long fixatie onder constante druk voor de evaluatie van emfyseem bij muizen
Summary
Hier gepresenteerd is een nuttig protocol voor Long fixatie die een stabiele aandoening creëert voor histologische evaluatie van Long specimens uit een muismodel van emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen met dezelfde constante druk kan oplossen zonder longcollaps of deflatie.
Abstract
Emfyseem is een belangrijk kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD). Studies met een emfysemateuze muismodel vereisen een optimale Long fixatie om betrouwbare histologische specimens van de longen te produceren. Vanwege de aard van de structurele samenstelling van de longen, die grotendeels uit lucht en weefsel bestaat, bestaat het risico dat het tijdens het fixatie proces instuilt of leegmaakt. Er bestaan verschillende Long fixatie methodes, die elk zijn eigen voor-en nadelen hebben. De Long fixatie methode die hier wordt gepresenteerd, maakt gebruik van constante druk om optimale weefsel evaluatie mogelijk te maken voor studies met een emfysemateuze muis Long-model. Het belangrijkste voordeel is dat het in één keer veel longen met dezelfde aandoening kan oplossen. Long specimens worden verkregen uit chronische sigarettenrook blootgestelde muizen. Long fixatie wordt uitgevoerd met behulp van gespecialiseerde apparatuur die de productie van constante druk mogelijk maakt. Deze constante druk handhaaft de longen in een redelijk opgeblazen toestand. Zo genereert deze methode een histologisch monster van de longen dat geschikt is om door sigarettenrook veroorzaakte milde emfyseem te evalueren.
Introduction
COPD is een van de leidende wereldwijde oorzaken van overlijden1. Sigarettenrook is de belangrijkste oorzaak van COPD, maar de mechanismen van pathogenese blijven niet volledig gedefinieerd. COPD toont twee hoofdkenmerken, waaronder progressieve beperking van de luchtstroom en een abnormale ontstekingsreactie van de longen. Emfysemateuze stoornis treedt vaak op in de longen van COPD-patiënten2. De pathologische bevindingen van emfyseem worden gekenmerkt door alveolaire wand vernietiging3. Er zijn verschillende diersoorten gebruikt voor het genereren van COPD-modellen in vivo (d.w.z. honden, cavia’s, apen en knaagdieren)4. Echter, de muis is uitgegroeid tot de meest gebruikte in de bouw van COPD modellen. Dit heeft vele voordelen, met inbegrip van de lage kosten, het vermogen om genetisch gemodificeerd, uitgebreide genoominformatie beschikbaarheid, beschikbaarheid van antilichamen, en het vermogen om een verscheidenheid van muis stammen gebruiken5. Momenteel is er geen muismodel dat de volledige kenmerken van menselijke COPD kan nabootsen; individuele onderzoekers moeten dus kiezen welk model het meest geschikt is voor het specifieke COPD-onderzoek6. De emfysemateuze muismodel is een van de vele COPD Muismodellen die momenteel beschikbaar zijn. Aanvullende modellen omvatten de exacerbatie muismodel, systemische co-morbidities model, en COPD susceptibiliteit model7.
Het emfysemateuze muismodel kan worden gegenereerd door verschillende soorten exogene agentia, waaronder chemische agentia en blootstelling aan sigarettenrook4. Chemische blootstelling (bv. aan elastase) produceert een ernstig type emfyseem, terwijl sigarettenrook resulteert in milde emfyseem8,9. Sigarettenrook wordt verondersteld de belangrijkste oorzaak te zijn voor de pathogenese van COPD; Daarom is de keuze van sigarettenrook als middel om een COPD-muismodel te creëren redelijk10. Veel studies hebben sigarettenrook gebruikt om emfyseem in de muis te maken. Zo heeft Nikula et al. met succes een emysemateuze muismodel gemaakt van B6C3F1 vrouwelijke muizen door ze bloot te stellen aan sigarettenrook gedurende 7 of 13 maanden11. We hebben ook een emysemateuze muismodel ingesteld via senescentie marker proteïne/SMP-30 KO muizen12. Het is cruciaal om een Long fixatie methode uit te voeren die dit milde emfyseem-model door blootstelling aan sigarettenrook goed kan visualiseren.
Er zijn verschillende methoden voor Long fixatie vastgesteld13. Er is echter geen gouden standaardmethode voor longweefsel fixatie voor het evalueren van emfyseem14. Verschillende studies van dit Lab hebben aangetoond dat het hier gepresenteerde fixatiesysteem nuttig is door een stabiele conditie te creëren voor het evalueren van emfyseem12,15,16,17,18. Het belangrijkste voordeel van het huidige systeem is dat het veel longen met dezelfde aandoening in één keer kan repareren zonder longcollaps of deflatie. Het huidige Long fixatiesysteem gebruikt een aantal speciale apparatuur waarmee Long specimens gedurende een bepaalde periode kunnen worden opgeblazen bij een geschikte constante druk. Deze speciale uitrusting bestaat uit drie delen, waaronder een onderste container, bovenste container en pomp. Long specimens worden in de onderste container geplaatst die is verbonden met bevestigingsmiddelen onder druk, wat resulteert in een 25 cmH2O drukverschil in het niveau van de agentia tussen de bovenste en onderste containers19.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde fixatie procedure voor knaagdieren longen is niet nieuw; Dit systeem heeft echter verschillende voordelen. Ten eerste, het kan veel longen (maximaal 20) met dezelfde aandoening in één keer te repareren. De vereniging van Toxicologic pathologie stelt dat de druk voor zwaartekracht instillatie variëren van 22 – 25 cmH2O22. Met name, verschillende studies hebben uitgevoerd Long fixatie bij een druk van 25 CMH2O13,<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gesteund door JSPS KAKENHI Grantnummer 26461199 (T. Sato) en het Instituut voor milieu-en genderspecifieke geneeskunde, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). De Funder had geen rol in het ontwerp van de huidige methodes en bij het schrijven van het manuscript.
Materials
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
Riferimenti
- Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
- Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
- Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
- Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
- Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
- Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
- Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
- Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
- Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
- Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
- Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
- Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
- Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
- Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
- Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
- Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).
- Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).
