Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi
Summary
Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.
Abstract
L’enfisema è una caratteristica significativa della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Gli studi che coinvolgono un modello murino enfisematoso richiedono una fissazione polmonare ottimale per produrre campioni istologici affidabili del polmone. A causa della natura della composizione strutturale del polmone, che consiste in gran parte di aria e tessuto, c’è il rischio che collassi o si sgonfi durante il processo di fissazione. Esistono vari metodi di fissaggio polmonare, ognuno dei quali ha i propri vantaggi e svantaggi. Il metodo di fissazione polmonare qui presentato utilizza una pressione costante per consentire una valutazione ottimale dei tessuti per gli studi che utilizzano un modello polmonare di topo infisematoso. Il vantaggio principale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta. Gli esemplari polmonari sono ottenuti da topi cronici esposti al fumo di sigaretta. La fissazione polmonare viene eseguita utilizzando apparecchiature specializzate che consentono la produzione di pressione costante. Questa pressione costante mantiene il polmone in uno stato ragionevolmente gonfiato. Così, questo metodo genera un esemplare istologico del polmone che è adatto per valutare il fumo di sigaretta indotta enfisema lieve.
Introduction
La BPCO è una delle principali cause di morte a livello mondiale1. Il fumo di sigaretta è la causa più importante della BPCO, ma i meccanismi di patogenesi rimangono incompleti. La BPCO dimostra due caratteristiche principali, tra cui la progressiva limitazione del flusso d’aria e una risposta infiammatoria anormale del polmone. Il disturbo dell’insensato si verifica frequentemente nei polmoni dei pazienti affetti da BPCO2. I risultati patologici dell’enfisema sono caratterizzati dalla distruzione della parete alveolare3. Diverse specie animali sono state utilizzate per generare modelli di BPCO in vivo (ad esempio cani, porcellini d’India, scimmie e roditori)4. Tuttavia, il mouse è diventato il più comunemente utilizzato nella costruzione di modelli di BPCO. Questo ha molti vantaggi, tra cui il suo basso costo, la capacità di essere geneticamente modificato, ampia disponibilità di informazioni genomiche, disponibilità di anticorpi, e la capacità di utilizzare una varietà di ceppi di topo5. Attualmente, non esiste un modello di mouse in grado di imitare tutte le caratteristiche della BPCO umana; pertanto, i singoli ricercatori devono scegliere quale modello è più adatto per la ricerca specifica sulla BPCO6. Il modello murino enfisematoso è uno dei molti modelli di topo BPCO attualmente disponibili. Altri modelli includono il modello del mouse di esacerbazione, il modello di co-morbidità sistemiche e il modello di suscettibilità della BPCO7.
Il modello murino enfisematoso può essere generato da diversi tipi di agenti esogeni, tra cui agenti chimici e esposizione al fumo di sigaretta4. L’esposizione chimica (ad esempio, per elastasi) produce un grave tipo di enfisema, mentre il fumo di sigaretta provoca un lieve enfisema8,9. Si ritiene che il fumo di sigaretta sia la causa principale della patogenesi della BPCO; pertanto, la scelta del fumo di sigaretta come mezzo per creare un modello di topo BPCO è ragionevole10. Molti studi hanno usato il fumo di sigaretta per creare enfisema nel mouse. Ad esempio, Nikula ealtri hanno creato con successo un modello di topo enfisematoso da topi femminili B6C3F1 esponendoli al fumo di sigaretta per 7 o 13 mesi11. Abbiamo anche stabilito un modello di topo enfisematoso tramite proteina marcatore di senescenza/topi SMP-30 KO12. È fondamentale eseguire un metodo di fissazione polmonare in grado di visualizzare correttamente questo modello di enfisema lieve dall’esposizione al fumo di sigaretta.
Sono stati stabiliti vari metodi per la fissazionepolmonare 13. Tuttavia, non esiste un metodo gold standard di fissazione del tessuto polmonare per la valutazione dell’enfisema14. Diversi studi di questo laboratorio hanno dimostrato che il sistema di fissazione qui presentato è utile creando una condizione stabile per la valutazione dell’enfisema12,15,16,17,18. Il vantaggio principale del sistema attuale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta senza collasso polmonare o deflazione. L’attuale sistema di fissazione polmonare utilizza alcune attrezzature speciali che consentono ai campioni polmonari di essere gonfiati ad una pressione costante appropriata per un determinato periodo. Questa attrezzatura speciale è composta da tre parti, tra cui un contenitore inferiore, contenitore superiore e pompa. I campioni polmonari vengono collocati nel contenitore inferiore collegato agli agenti di fissaggio pressurizzati, determinando una differenza di pressione di 25 cmH2O nel livello degli agenti tra i contenitori superiore e inferiore19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura di fissazione per i polmoni dei roditori qui presentata non è una novità; tuttavia, questo sistema ha diversi vantaggi. In primo luogo, può fissare molti polmoni (massimo 20) con la stessa condizione in una sola volta. La Società di Patologia Tossicologica afferma che la pressione per l’instillazione gravitazionale varia da 22 a 25 cmH2O22. In particolare, diversi studi hanno eseguito fissazione polmonare ad una pressione di 25 cmH2O13…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte da JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e dall’Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Il fingeto non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dei metodi attuali e nella scrittura del manoscritto.
Materials
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
Riferimenti
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