Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones
Summary
Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.
Abstract
El enfisema es una característica significativa de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los estudios que involucran un modelo de ratón enfisematoso requieren una fijación pulmonar óptima para producir muestras histológicas confiables del pulmón. Debido a la naturaleza de la composición estructural del pulmón, que consiste en gran parte de aire y tejido, existe el riesgo de que colapse o se desinflen durante el proceso de fijación. Existen varios métodos de fijación pulmonar, cada uno de los cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. El método de fijación pulmonar presentado aquí utiliza presión constante para permitir una evaluación óptima del tejido para estudios utilizando un modelo de pulmón de ratón enfisematoso. La principal ventaja es que puede arreglar muchos pulmones con la misma condición a la vez. Los especímenes pulmonares se obtienen de ratones crónicos expuestos al humo del cigarrillo. La fijación pulmonar se realiza utilizando equipos especializados que permiten la producción de presión constante. Esta presión constante mantiene el pulmón en un estado razonablemente inflado. Por lo tanto, este método genera un espécimen histológico del pulmón que es adecuado para evaluar el enfisema leve inducido por humo de cigarrillo.
Introduction
La EPOC es una de las principales causas mundiales de muerte1. El humo del cigarrillo es la causa más importante de la EPOC, pero los mecanismos de la patogénesis siguen estando incompletamente definidos. La EPOC demuestra dos características principales, incluyendo la limitación progresiva del flujo de aire y una respuesta inflamatoria anormal del pulmón. El trastorno hemofusostoso ocurre con frecuencia en los pulmones de los pacientes con EPOC2. Los hallazgos patológicos del enfisema se caracterizan por la destrucción de la pared alveolar3. Se han utilizado varias especies animales para generar modelos de EPOC in vivo (es decir, perros, conejillos de indias, monos y roedores)4. Sin embargo, el ratón se ha convertido en el más utilizado en la construcción de modelos de EPOC. Esto tiene muchas ventajas, incluyendo su bajo costo, capacidad para ser modificado genéticamente, amplia disponibilidad de información genómica, disponibilidad de anticuerpos, y la capacidad de utilizar una variedad de cepas de ratón5. En la actualidad, no hay ningún modelo de ratón que pueda imitar todas las características de la EPOC humana; por lo tanto, los investigadores individuales deben elegir qué modelo es el más adecuado para la investigación específica de la EPOC6. El modelo de ratón enfisematoso es uno de los muchos modelos de ratón EPOC que están disponibles actualmente. Los modelos adicionales incluyen el modelo de ratón de exacerbación, el modelo de comorbilidades sistémicas y el modelo de susceptibilidad a la EPOC7.
El modelo de ratón enfisematoso puede ser generado por varios tipos de agentes exógenos, incluyendo agentes químicos y exposición al humo del cigarrillo4. La exposición química (p. ej., a la elestasa) produce un tipo grave de enfisema, mientras que el humo del cigarrillo produce un enfisema leve8,9. Se cree que el humo del cigarrillo es la principal causa de la patogénesis de la EPOC; por lo tanto, la elección del humo del cigarrillo como medio para crear un modelo de ratón COPD es razonable10. Muchos estudios han utilizado humo de cigarrillo para crear enfisema en el ratón. Por ejemplo, Nikula y otros crearon con éxito un modelo de ratón enfisematoso de ratones hembra B6C3F1 exponiéndolos al humo del cigarrillo durante 7 o 13 meses11. También hemos establecido un modelo de ratón enfisematoso a través de la proteína marcador de senescencia/SMP-30 KO ratones12. Es crucial realizar un método de fijación pulmonar que pueda visualizar adecuadamente este modelo de enfisema leve por exposición al humo del cigarrillo.
Se han establecido varios métodos para la fijación pulmonar13. Sin embargo, no existe un método estándar de oro de fijación de tejido pulmonar para evaluar el enfisema14. Varios estudios de este laboratorio han demostrado que el sistema de fijación presentado aquí es útil mediante la creación de una condición estable para la evaluación del enfisema12,15,16,17,18. La principal ventaja del sistema actual es que puede fijar muchos pulmones con la misma condición a la vez sin colapso pulmonar o deflación. El sistema de fijación pulmonar actual utiliza algunos equipos especiales que permiten inflar muestras pulmonares a una presión constante adecuada durante un período determinado. Este equipo especial consta de tres partes, incluyendo un contenedor inferior, contenedor superior y bomba. Las muestras pulmonares se colocan en el contenedor inferior que está conectado a los agentes de fijación presurizados, lo que resulta en una diferencia de presión de 25 cmH2O en el nivel de agentes entre los contenedores superior e inferior19.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento de fijación para los pulmones de roedores que se presenta aquí no es novedoso; sin embargo, este sistema tiene varias ventajas. En primer lugar, puede fijar muchos pulmones (máximo de 20) con la misma condición a la vez. La Sociedad de Patología Toxicológica afirma que la presión por la insclasificación de gravedad varía de 22–25 cmH2O22. En particular, varios estudios han realizado fijación pulmonar a una presión de 25 cmH2O13<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) y el Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño de los métodos actuales y en la escritura del manuscrito.
Materials
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
Riferimenti
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