Lung fixering under konstant tryck för utvärdering av emfysem hos möss
Summary
Presenteras här är ett användbart protokoll för lung fixering som skapar ett stabilt tillstånd för histologisk utvärdering av lungprover från en musmodell av emfysem. Den största fördelen med denna modell är att det kan fixa många lungor med samma konstanta tryck utan lung kollaps eller deflation.
Abstract
Emfysem är ett viktigt inslag i kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol). Studier med en emfysem musmodell kräver optimal lung fixering för att producera tillförlitliga histologiska prover av lungan. På grund av arten av lungans strukturella sammansättning, som består till stor del av luft och vävnad, det finns en risk att det kollapsar eller tör under Fixeringsprocessen. Olika lungfixeringsmetoder finns, som var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Den lung bindnings metod som presenteras här använder konstant tryck för att möjliggöra optimal vävnads utvärdering för studier med en emfysem mus lung modell. Den största fördelen är att det kan fixa många lungor med samma tillstånd på en gång. Lung prov erhålls från kroniska cigarettrök-exponerade möss. Lung fixering utförs med hjälp av specialiserad utrustning som möjliggör produktion av konstant tryck. Detta konstanta tryck upprätthåller lungan i ett rimligt uppblåst tillstånd. Sålunda, denna metod genererar ett histologiskt prov av lungan som är lämplig för att utvärdera cigarettrök-inducerad mild emfysem.
Introduction
KOL är en av de ledande globala dödsorsakerna1. Cigarettrök är den viktigaste orsaken till kol, men mekanismerna för patogenesen förblir ofullständigt definierade. KOL uppvisar två huvudegenskaper, inklusive progressiv begränsning av luftflödet och en onormal inflammatorisk reaktion på lungan. Emfysematös störning förekommer ofta i lungorna av KOL-patienter2. Den patologiska fynd av emfysem kännetecknas av alveolära vägg förstörelse3. Flera djurarter har använts för att generera kol-modeller in vivo (dvs. hundar, marsvin, apor och gnagare)4. Men musen har blivit den mest använda i byggandet av kol-modeller. Detta har många fördelar, inklusive dess låga kostnader, förmåga att vara genetiskt modifierade, omfattande genomisk information tillgänglighet, tillgång till antikroppar, och förmåga att använda en mängd olika mus stammar5. För närvarande finns det ingen musmodell som kan efterlikna alla funktioner i human kol; Därför måste enskilda forskare välja vilken modell som lämpar sig bäst för den specifika kol-forskningen6. Emfysematous musmodell är en av många kol musmodeller som för närvarande är tillgängliga. Ytterligare modeller inkluderar exacerbation musmodell, systemisk Co-morbidities modell, och kol känslighet modell7.
Emfysematous musmodell kan genereras av flera typer av EXOGEN agenter, inklusive kemiska agens och cigarettrök exponering4. Kemisk exponering (t. ex. till elastase) ger en allvarlig typ av emfysem, medan cigarettrök resulterar i mild emfysem8,9. Cigarettrök tros vara den främsta orsaken till patogenesen av kol; Därför är valet av cigarettrök som ett sätt att skapa en kol musmodell rimligt10. Många studier har använt cigarettrök för att skapa emfysem i musen. Till exempel skapade Nikula et al. framgångsrikt en emfysematous musmodell från B6C3F1 kvinnliga möss genom att utsätta dem för cigarettrök för 7 eller 13 månader11. Vi har också etablerat en emfysematous musmodell via åldras markör protein/SMP-30 Ko möss12. Det är viktigt att utföra en lungfixeringsmetod som korrekt kan visualisera denna milda emfysem modell av cigarettrök exponering.
Olika metoder för lungfixering har fastställts13. Emellertid, det finns ingen guldmynt standardmetod för lungvävnad fixering för att utvärdera emfysem14. Flera studier från detta laboratorium har visat att fixeringssystemet presenteras här är användbart genom att skapa en stabil förutsättning för att utvärdera emfysem12,15,16,17,18. Den största fördelen med det nuvarande systemet är att det kan fixa många lungor med samma tillstånd på en gång utan lung kollaps eller deflation. Det nuvarande lungfixeringssystemet använder viss speciell utrustning som gör att lungprover kan pumpas vid ett lämpligt konstant tryck under en given period. Denna speciella utrustning består av tre delar, inklusive en lägre behållare, övre behållare, och pump. Lungprover placeras i den nedre behållaren som är ansluten till trycksatta fixeringsmedel, vilket resulterar i en 25 cmH2O tryckskillnad i nivån av agenter mellan de övre och nedre behållarna19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixeringsproceduren för gnagare lungor presenteras här är inte roman; Detta system har dock flera fördelar. För det första, det kan fixa många lungor (max 20) med samma tillstånd på en gång. Sällskapet av Toxicologic patologi påstår att pressa för gravitation instillation varierar från 22 – 25 cmH2nolla22. I synnerhet har flera studier utfört lung fixering vid ett tryck på 25 CMH2O13,19,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) och Institutet för miljö-och könsspecifik medicin, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Finansiär hade ingen roll i utformningen av de nuvarande metoderna och skriftligen manuskriptet.
Materials
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
Riferimenti
- Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
- Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
- Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
- Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
- Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
- Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
- Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
- Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
- Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
- Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
- Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
- Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
- Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
- Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
- Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
- Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).
- Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).
