低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル
Summary
ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。
Abstract
好中球リリース好中球細胞外トラップ (網) を取り込んで微生物を破壊することができますをアクティブ化します。最近の研究では、ネットがさまざまな病気プロセス、自己免疫疾患、血栓症、腫瘍の転移などに関与していることを示唆しています。ここで、網に付着後成長無料腫瘍細胞の捕捉中にネット活動を検出する詳細な培養技術を紹介します。第 1 に、開腹症例から術後腹腔洗浄液から低密度好中球 (LDN) を集めました。LDN の短期養殖緑蛍光核と染色体の対比染色に視覚化された大規模なネット形成で起因しました。ひと胃癌細胞株ネットと NUGC 4、OCUM 1、MKN45 の共同培養後多くの腫瘍細胞は網によって閉じ込められました。その後、添付ファイルは、DNase I. 低速度撮影ビデオは網によって閉じ込められている腫瘍細胞が死んでいなかったこと明らかに取り付けた網の劣化によって完全に廃止されたが、代わりに連続培養における旺盛します。これらのメソッドは、ネットとセルと材料の様々 なタイプの接着剤の相互作用の検出に適用可能性があります。
Introduction
循環血液における多形核好中球は通常単核細胞から密度グラデーション製法によって区切られます。ただし、CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)、および CD14(-) の表現型を持つ低密度好中球 (LDN) として知られているいくつかの好中球、単核細胞と共同浄化されました。LDN の相対数は、大幅自己免疫疾患1、2敗血症3がん4,5など様々 な病態で増加します。以前の研究では、LDN が好中球6の表現型と機能別のクラスであることを示しています。循環血液で LDN は通常の密度好中球2,7より好中球細胞外トラップ (網) を生成する可能性が高いことに注意してください。ネットは核酸、ヒストンやプロテアーゼ、粉粒体、ゾル性細胞質蛋白質から成る web のような構造であり、彼らは効率的にわなに掛けることができる病原体8を破壊して。
最近では、ネットをキャプチャだけでなく、微生物も血小板、血栓形成9および腫瘍転移10,11に役立つ腫瘍細胞を循環する示されています。しかし、ネットと血小板または腫瘍細胞間接着剤の相互作用の背後にある分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近では、体外で接着アッセイは、骨髄性白血病細胞 (K56212) および肺癌細胞 (A54913) が β3 と β 1 インテグリンを介してネットに接続するを明らかにしました。著者には、好中球由来及びホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 接着基板14によって活性化ネット ストックが使用されます。かどうかの生産網と同じ分子構造を保持”由来の無細胞ネット証券「高速遠心分離によって分離されたこのアッセイは、好中球の不在で NET コンポーネントと現実の相互作用の検出を使用できますが、それは議論の余地vivo。最近、我々 は腹部手術に含まれる大規模な網を生成、腹膜転移15を引き起こす腫瘍細胞に接続されている多くの成熟した LDN 後その腹腔洗浄液を発見します。本研究では、物理的な操作をすることがなくそのままネットへの腫瘍細胞の接着を調べた正常に。ネットと無料の腫瘍細胞間接着の相互作用を検出する技術の詳細を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前の研究は、10、生体内で純基板11循環腫瘍細胞をトラップできることを報告しています。転移性乳癌細胞は、好中球を刺激しターゲット器官17の腫瘍細胞の成長を支援するネットの形成を誘導する示されています。さらに、術後の洗浄液から LDN の短期的な文化が効率的にさらに刺激15せず腫瘍細胞をわ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術と事務作業、さん j. 篠原と I. Nieda に感謝します。また、松本史朗夫妻、秀典春田、倉科健太郎、高橋一也は、手術室でのサンプルの収集への協力を感謝いたします。この仕事は、学術振興 (17 K 10606) 教育省、科学、スポーツ、日本文化と日本社会科学研究費補助金によって支えられました。
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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